Клиническая морфология онкология и патология Лекция 1

Клиническая морфология, онкология и патология Лекция № 1 Введение. Методы исследований в клинической патологии Прокушенкова Елена Геннадьевна кандидат ветеринарных наук, доцент

Вопросы лекции 1. Предмет и содержание дисциплины. 2. История развития дисциплины. 3. Правила формулировки клинического и патологоанатомического диагнозов. 4. Методы исследований в клинической патологии. 5. Правила отбора биологического материала для различных видов исследований.

Рекомендуемая литература 1. Патологічна анатомія тварин. П. П. Урбанович, М. К. Потоцький, Г. А. Гевкан. – 2008. 2. Ветеринарная клиническая онкология. П. Ф. Терехов. – 1983. 3. Онкологические заболевания мелких домашних животных. Ричард А. С. Уайт. – 2003.

Рекомендуемая литература 4. Микроскопические исследования в диагностике заболеваний мелких домашних животных. С. В. Середа и др. 5. Опухоли мелких домашних животных: клиника, диагностика, лечение. Под редакцией д. м. н. чл-корр. НАНУ В. Ф. Чехуна д. в. н. чл-корр. УААН А. И. Мазуркевича. - 2001. 6. Горальський Л. П. , Хомич В. Т. , Кононський О. І. Основи гістологічної техніки і морфофункціональні методи дослідження у нормі та при патології. – 2005.

1. Предмет и содержание дисциплины • Цель дисциплины – приобретение теоретических и практических навыков для проведения клинических исследований болезней животных и оформления соответствующей документации. Ø Методические подходы к проведению морфологических исследований в ветеринарной медицине Ø Освоение основ патогистологических исследований Ø Особенностей патогистологических изменений органов и тканей при повреждениях, расстройствах крово- и лимфообращения, развитию приспособительных и компенсаторных процессов, воспалении, пороках развития и опухолях.

2. История развития дисциплины 1. Анатомический (до начала XIX века) Дж. Морганьи (1685 -1777) К. Рокитанский (1804 -1878) 2. Микроскопический (XIX век – середина ХХ века) Р. Вирхов (1821 -1902) М. М. Руднев 3. Ультрамикроскопический (с середины ХХ века) 4. Современный – патологическая анатомия живого организма

3. Правила формулировки клинического и патологоанатомического диагнозов Диагноз – это краткое медицинское заключение об имеющемся заболевании (травме), отклонении в состоянии здоровья или о причине смерти.

Установление диагноза болезни – самый главный этап в работе врача. Он составляет заключительную часть процесса диагностики. В диагнозе должна быть проявлена врачебная логика, умение формулировать свои мысли, связывать воедино симптомы и синдромы и делать выводы о сущности болезни, ее осложнениях, проявлениях и исходе.

Основные виды диагнозов: l Клинический (прижизненный) – – – l l предварительный (при недостаточной полноте обследования, диагноз может быть симптоматическим или синдромологическим), заключительный, в нем указывают все выявленные в процессе диагностики заболевания в соответствии с принятыми классификациями, выделяя на первое место основное, а также клинические характеристики (этиология, стадии болезни, степени тяжести, функциональные нарушения и т. д. ); Патологоанатомический (посмертный); Судебно-медицинский (прижизненный и посмертный).

Разделы диагноза: Основное заболевание; l Осложнения основного заболевания, которые желательно сгруппировать по степени тяжести; l Фоновые и конкурирующие болезни; l Сопутствующие заболевания. l

Основное заболевание • Нозологическая единица, имеющая в данный момент наиболее выраженные проявления, угрожающие здоровью и жизни • Первоначальная причина смерти

Комбинированное основное заболевание • Конкурирующие заболевания – две нозологические единицы, каждая из которых в отдельности могла бы привести к смерти • Фоновое заболевание – играет существенную роль в возникновении и развитии основного заболевания, хотя этиология у него иная

Осложнение основного заболевания • Это такой патологический комплекс который патогенетически или этиологически связан с основным заболеванием и существенно утяжеляет его течение, становясь нередко причиной смертельного исхода.

Сопутствующее заболевание • Заболевание, которое этиологически и патогенетически не связано с основным заболеванием и его осложнениями, не оказывает на их течение и развитие неблагоприятных влияний и не способствует наступлению смерти

«Если диагноз основан на лабораторных данных, врач должен быть уверен в надежности метода и в качестве выполнения исследования» Дж. Греф и соавторы, «Manual of Pediatric Therapeutics» , 1994 г. Обеспечение высокого качества лабораторных исследований – гарантия уверенности в достоверности результатов при проведении клинических испытаний.

СТРАТЕГИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Посмертная Прижизненная Корма и вода Биологические субстраты Химические исследования Биохимические исследования Патоморфологическая картина (кровь, моча, сперма и др. ) ПЦР-анализ Иммуноблоттинг Бак. исследования Токсикологические исследования Подбор схем вакцинаций Бак. исследования Гистологические, гистохимические исследования Химикотоксикологические исследования Гематологические исследования Бак. исследования ИФА Коррекция лечебных и профилакт. мероприятий Иммуногистохимия АНАЛИЗ И ОБОБЩЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Коррекция обменных процессов Коррекция рациона кормления ПОВЫШЕНИЕ СОХРАННОСТИ И ПРОДУКТИВНОСТИ ЖИВОТНЫХ Подбор эффективных дезинфектантов ЗДОРОВОЕ ПОГОЛОВЬЕ Оптимизация репродуктив ных качеств 16

4. Методы исследований в клинической патологии • Основной метод патологической анатомии – вскрытие (аутопсия) • Биопсия – (bios – жизнь, opsis – зрительное восприятие): - Диагностическая - Операционная • Цитологические исследования • Гистологические исследования • Иммуногистохимический анализ • Гибридизация

Виды препаратов фиксированных клеток Срез • тонкие (толщина более 1 мкм) • полутонкие (толщина менее 1 мкм) • ультратонкие (толщина менее 0, 1 мкм) Мазок • крови • красного костного мозга • спинномозговой жидкости • слюны • влагалищный • и др. Отпечаток • • селезенки тимуса печени слизистой оболочки мочевого пузыря • слизистой оболочки щеки • и др. Пленка • брюшины • плевры • мягкой мозговой оболочки • соединительной ткани • и др.

Виды биопсий § пункционная - материал получают путем пункции специальной иглой через кожу либо через небольшой разрез в тканях, § инцизионная (эксцизионная) - иссечение кусочка ткани, § аспирационная - отсасывание содержимого полого органа или полости шприцом либо специальным инструментом, § трепанобиопсия - забор костной ткани производят специальным инструментом, § кюретаж - выскабливание полости кюреткой, § эндоскопическая - проводится прицельно, под контролем зрения

Лаборатория патоморфологии и паразитологии Лаборатория гистологии и иммуноцитохимии Полное патологоанатомическое вскрытие Классическая гистология, цитология Иммуногистохимическая диагностика Микроструктурный анализ продукции и кормов Комплексное паразитологическое исследование

Патологоанатомическое вскрытие: - характер макроскопических прижизненных изменений в органах на финальном этапе развития болезни - причины смерти (непосредственные и определяющие) -проверка правильности и эффективности лечебно -профилактических мероприятий - проведение судебно-ветеринарной экспертизы 21

Классическая гистология и цитология: - микроструктурные и биохимические (цитохимические) изменения в клетках и тканях - установление тропизма возбудителя и оптимизация отбора образцов для его молекулярно-генетического анализа К О М П Л Е К С Н О С Т Ь О Р Г А Н О С П Е Ц И Ф И Ч Н О С Т Ь 22

Требования к отбору биологического материала для гистологических исследований 1. Свежесть материала 2. Отбор материала прицельный 3. Фиксация непосредственно после отбора 4. Фиксаторы (формалин 10%, спирт этиловый 96°) 5. Объем фиксирующей жидкости 1: 10 6. Правила транспортировки 23

Виды микротомов санный ротационный криостатный изготовление парафиновых срезов изготовление серийных парафиновых срезов изготовление срезов при температуре -20°С и ниже для гистохимии и иммуноцитохимии

ВНЕШНИЙ ВИД МИКРОТОМА

Иммуногистохимический анализ: МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Иммуногистохимические методы В основе лежит специфическое взаимодействие тканевых и клеточных антигенов животных или человека со специально полученными антителами, несущими на себе разнообразные метки.

Иммуногистохимия (иммуноцитохимия): - выявление и определение точной локализации антигенов возбудителей инфекционных заболеваний в гистологических срезах в результате их реакции с мечеными антителами - идентификация возбудителя в органах и тканях Позитивное иммуногистохимическое окрашивание при цирковирусной болезни свиней (PCVII) Иммуногистохимическая диагностика включает обязательное исследование органов иммунной системы (лимфатический узел, селезенка) и одного органа с учетом тропизма возбудителя инфекции (печень, почки, легкие и др. ). 28

ЭТАПЫ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА 1. Фиксация 2. Изготовление парафиновых блоков 3. Изготовление срезов 4. Депарафинизация и гидратация 5. Блокировка эндогенной пероксидазы 6. Блокировка неспецифической сорбции 7. Промывка (ФСБР) 8. Демаскировка АГ (МХО) 9. Промывка (ФСБР) 10. Инкубация со специфическими АТ 11. Промывка (ФСБР) 12. Инкубация с вторичными АТ 13. Промывка (ФСБР) 14. Визуализация (ДАБ) 15. Промывка (ФСБР) 16. Докраска гематоксилином 17. Дегидратация 18. Заключение срезов

Для исследования отбирают фрагменты органов и нефиксированном охлажденном виде доставляют в лабораторию. Замораживание образцов не желательно. В случае более продолжительной транспортировки материал фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине. Размер кусочков 10 мм х 5 мм 30

Микроструктурное исследование кормов: Средняя проба корма – 1 кг Для проверки структурных компонентов и выявления фальсификатов комбикормов, рыбной и мясокостной муки используется метод двухступенчатой микроскопии. Образец корма помещается под специальный микроскоп с компьютеризированной системой обработки изображения и рассматривается в различных диапазонах увеличения, что позволяет сделать точный анализ мельчайших частиц. Данная методика дает возможность со стопроцентной гарантией выявить фальсификацию и определить структурные компоненты кормов. 33

Микроструктурное исследование мясного сырья, полуфабрикатов, готовых мясных и комбинированных продуктов: Определение свежести мяса, замороженного, засоленного мяса, количественный и качественный состав мясных изделий, выявление фальсификации и нарушения рецептуры. Окраска по Ван-Гизон Окраска гематоксилином и эозином Окраска Судан 34 ІІІ

ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Комплексные исследования фекалий - Диагностика инвазионных заболеваний (трематодозы, цестодозы, нематодозы, протозоозы, энтомозы) физико-химические показатели микроскопическое исследование гельминтоовоскопия Требования к отбору материала 1. Свежесть 2. Масса пробы 5 -10 г. 3. Выборка (10% поголовья одной возрастной группы) 4. Посуда для транспортировки 5. Сопроводительный документ

ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Экономический ущерб Снижение привесов Снижение продуктивности Снижение конверсии корма Падеж

Исследование биологических субстратов и органов животных • • Кровь отбирают одноразовым шприцом вместимостью 5 -10 мл. Для предотвращения гемолиза и загрязнения пробы используемая посуда должна быть совершенно чистой, манипулировать кровью следует крайне осторожно, переливать кровь по стенке пробирки без напора, создаваемого шприцом. С целью получения крови для морфологических исследований применяют антикоагулянты либо специальные вакуумные системы отбора крови, содержащие антикоагулянт. В качестве антикоагулянта рекомендуется применять ЭДТАнатрий или ЭДТА-калий (0, 5 мл 1, 5% раствора на 10 мл крови). Необходимый для проведения анализа объем крови – 2 мл. Подсчет количества форменных элементов и концентрации гемоглобина допускается в течение суток. При длительной транспортировке кровь передается в термосе со льдом. Замораживание не допускается. 37

Исследование биологических субстратов и органов животных • Для биохимических исследований используют сыворотку и плазму крови. Сыворотку получают следующим образом: кровь без коагулянта ставят в пробирке в теплое место (37 -38°С); после сворачивания крови ее обводят по краю пробирки длинной иглой, а через несколько часов сыворотку отсасывают пипеткой и сохраняют в холодильнике. Большее количество сыворотки можно получить после центрифугирования. Плазму получают центрифугированием при 2 -3 тысячах оборотов в минуту стабилизированной гепарином (5 -10 ЕД/мл) крови. Необходимый для проведения биохимических исследований объем сыворотки или плазмы крови составляет от 2 до 10 мл в зависимости от перечня необходимых показателей. 38

Исследование биологических субстратов и органов животных • • Паренхиматозные органы (печень, почки) или образцы мышечной ткани для проведения химического и токсикологического анализа отбирают от свежепавшего (забитого) животного. Для исследования направляют образцы органов массой не менее 50 г от каждого животного, а также мышечную ткань в том же количестве, отобранную из ягодичной группы мышц. В случае, если пересылка материала требует длительного времени, отобранные образцы замораживают при температуре – 20°С и направляют в замороженном виде с хладогенами. При отборе образцов кости для исследования направляют эпифизы трубчатых костей (как правило, плечевой, бедренной или большеберцовой, массой около 100 г) в охлажденном или замороженном виде в зависимости от времени транспортировки. 39

Полимеразная цепная реакция метод определения конкретных последовательностей ДНК или РНК в любом биологическом образце l ПЦР – это осуществляемая in vitro амплификация (т. е. увеличение числа копий) нуклеиновых кислот, инициируемая синтетическими олигонуклеотидными праймерами l

ИМУНОХИМИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРАВИЛА ОТБОРА И ТРАНСПОРТИРОВКИ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПЦР ИССЛЕДОВАНИЯ СТАБИЛИЗИРОВАННАЯ КРОВЬ Для ПЦР исследования кровь отбирают в объеме не меньше 1 – 1, 5 мл в стерильные шприцы или пробирки с 10% раствором ЭДТА (Трилон Б) из расчета 1: 20 (0, 5 мл стабилизатора и 10 мл крови). Закрытую пробирку или шприц с кровью несколько раз плавно переворачивают для тщательного смешивания стабилизатора с кровью, охлаждают до 2 - 8 °С и в этот же день доставляют в лабораторию. Заморозка не допускается!!!

ИМУНОХИМИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРАВИЛА ОТБОРА И ТРАНСПОРТИРОВКИ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПЦР ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ И АБОРТИРОВАННЫЕ ПЛОДЫ С КУСОЧКАМИ ПЛАЦЕНТЫ Образцы патологического материала и абортированных плодов с кусочками плаценты помещают в стерильные флаконы или пакеты, герметично их закрывают, слаживают в общий полиэтиленовый пакет или коробку и тщательно упаковывают для предотвращения протекания. Охлаждают до 2 - 8 °С и в этот же день транспортируют в лабораторию. Допускается разовая заморозка и хранение материала при температуре не выше минус 16 °С в течение 30 дней. МОЧА У животных отбирают утреннюю мочу в стерильные пробирки или флаконы (минимум 10 – 15 мл). Затем, в эти же флаконы вносят глицерин, с расчётом 10% от объёма мочи (к 10 мл мочи добавляют 1 мл глицерина). Пробирки герметично закрывают пробками и аккуратно перемешивают. Образцы охлаждают при температуре +2 – +8 о. С. Допускается разовая заморозка и хранение при температуре не выше минус 16 °С в течение 3 -5 дней. Образцы помещаем в термос со льдом. Герметично запаковывают и транспортируют в лабораторию.

ИМУНОХИМИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРАВИЛА ОТБОРА И ТРАНСПОРТИРОВКИ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПЦР ИССЛЕДОВАНИЯ Аппликатор СМЫВЫ Для отбора смывов нужно использовать стерильные ватные тампоны и пробирки объемом 1, 5 – 2 мл или аппликаторы, в которые вносят 500 мкл стерильного физиологического раствора или раствора фосфатного буфера р. Н 7, 2 -7, 4.

ИМУНОХИМИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРАВИЛА ОТБОРА И ТРАНСПОРТИРОВКИ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПЦР ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕКАЛИИ Фекалии отбирают в стерильные пластиковые контейнеры, охлаждают до 2 - 8 °С и в этот же день транспортируют в лабораторию. Допускается разовая заморозка и хранение материала при температуре не выше минус 16 °С в течение 30 дней.

ИМУНОХИМИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРАВИЛА ОТБОРА И ТРАНСПОРТИРОВКИ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИФА ИССЛЕДОВАНИЯ Для иммуноферментного анализа используют сыворотку крови Кровь для исследования отбирают в объеме 4 – 5 мл в стерильные шприцы или пробирки без антикоагулянта. Желательно использовать одноразовые системы взятия крови с активатором свёртывания. Шприц или пробирку помещают в теплое место для отделения сыворотки крови, которую затем сливают в пробирку или оттягивают одноразовым шприцом, предупреждая попадание взвеси эритроцитов. Образцы охлаждают до +2 - +8 °С и в течение 24 ч транспортируют в лабораторию. С целью более длительного хранения, образцы сыворотки замораживают при температуре не выше -16 -20 °С. Многократное замораживание и оттаивание образцов не допускается!!!

ПОСМЕРТНАЯ ДИАГНОСТИКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ БОЛЕЗНЕЙ • Поражения респираторной системы: легкие с сердцем (с перевязанными лигатурой сосудами или отдельно кровь из сердца в шприце), печень, селезёнка, лимфоузлы, целые трупы. • Поражения ЖКТ: сердце (с перевязанными лигатурой сосудами или отдельно кровь из сердца в шприце), печень, селезёнка, лимфоузлы, трубчатые кости, целые трупы.

Упаковка и транспортировка патологического материала • • Отбор производится как можно быстрее после гибели животного Упаковывается в водонепроницаемую тару Замораживается длительной транспортировки Если возможна быстрая доставка – обкладывается хладагентами

Витальная диагностика бактериальных болезней • Респираторные болезни – отбирают мазки из носовой полости свабами с транспортной средой Эймса без угля. • Поражения ЖКТ – отбирают мазки из прямой кишки свабами с транспортной средой Эймса с углём, фекалии в стерильном пластиковом стакане. • Метриты, баланопоститы – мазки из половых органов свабами с транспортной средой Эймса с углём. • Маститы – секрет поражённых долей в стерильном пластиковом стакане.

Упаковка и транспортировка биологического материала • Мазки без транспортных сред и материалы в стерильной таре упаковывают с хладагентами • Мазки с транспортными средами упаковывают без хладагенов

Благодарим за внимание!

НИЦ БИОБЕЗОПАСНОСТИ И ЭКОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ РЕСУРСОВ АПК ДГАУ Методические подходы морфологических исследований в диагностике заболеваний животных Прокушенкова Елена Геннадьевна, старший научный сотрудник, канд. вет. наук 51

Biosafety center Благодарю за внимание! 52