Клиническая иммунология Основные задачи клинической

Клиническая иммунология

Основные задачи клинической иммунологии 1. Изучение и моделирование функций иммунной системы в норме 2. Оценка иммунного статуса. Мониторинг состояния иммунной системы. 3. Выявление болезней иммунной системы, анализ иммунопатогенеза различных заболеваний 4. Иммунокоррекция 5. Иммунопрофилактика (вакцинация) 6. Иммуноэпидемиология

Иммунный статус – комплекс количественных и качественных показателей иммунной системы в данный момент времени. Иммунный статус определяют с помощью стандартных, доступных, общепринятых тестов, позволяющих получить ориентировочные сведения об общих параметрах иммунной системы.

Сбор иммунологического анамнеза • Одним из важнейших разделов работы врача иммунолога- аллерголога является сбор иммунологического анамнеза, в ходе которого необходимо выявить отдельные виды иммунопатологии. • В дальнейшем от правильного диагноза в многом зависит дальнейший успех в лечении заболеваний

Формула крови человека • Тип клеток процент Кол-во в 1 мкл • • Лейкоциты 100 4300 -9200 • Нейтрофилы 45 -70 2000 -5800 • Моноциты 3 -11 60 -90 • Базофилы 0 -5 0 -300 • Тромбоциты - 2000000 -300000 • Лимфоциты 17 -41 1200 -3000 • ЭРИТРОЦИТЫ - 4 -5 МИЛ.

Нормальная гемограмма Тип клеток % Кол-во в мл Лейкоциты 100 4300 -9200 Нейтрофилы 45 -70 2000 -5800 Моноциты 3 -11 90 -60 Эозинофилы 0 -5 0 -300 Базофилы 0 -1 0 -65 Тромбоциты - 200 000 – 300 000 Лимфоциты 17 -41 1200 – 3000 Эритроциты - 4 -5 млн.

Количество основных клеточных популяций в периферической крови человека % от общего количества Маркеры лимфоцитов Кол-во в мл

Содержание иммуноглобулинов Показатель Значение Ig. A 0, 8 -4 г/л Ig. G 5, 3 -16, 5 г/л Ig. M 0, 5 -2, 0 г/л Ig. E 0, 01 -0, 003 Фагоцитоз Candida alb. - 1 -25 Фагоцитарное число Staphylococcus – 4 -9 Candida alb. - 40 -90% Фагоцитарный индекс Staphylococcus – 40 -80%

Инфекционный синдром • : • Длительный субфебрилитет (повышение температуры до 37, 0 -37, 5 С) или лихорадка; • Лимфадениты (увеличение лимф. узлов); • Бактериальные инфекции кожи и подкожной клетчатки (пиодермии, фурункулез ); • Грибковое поражение ногтей, слизистых оболочек (кандидоз);

• Частые ОРЗ (более 4 раз в год у взрослых и более 6 раз в год у детей), хронические и часто повторяющиеся инфекции ЛОР- органов (синуситы, отиты ), органов дыхания (бронхиты, пневмонии); • Рецидивирующий герпес (генитальный, опоясывающий лишай); • Хронические инфекции мочеполовой системы (уретриты, пиелонефриты и др. ); • Генерализованные инфекции (сепсис)

Аллергический синдром: • Наличие в анамнезе заболеваний кожи (экзема, крапивница, контактный дерматит), • Лор-органов (аллергический ринит), органов дыхания (бронхиальная астма) аллергического генеза; • Непереносимость пищевых продуктов , лекарств, пыльцы и др.

Аутоиммунный синдром: • Воспаление суставов конечностей , позвоночника, крестцово-подвздошных сочленений: • Поражение кожи (геморрагические высыпания, дискоидные очаги, фотосенсибилизация), алопеция; • Указания на поражение почек (гломерулонефрит) и печени (гепатит); • Цитопения (снижение количества клеток крови)

• Наследственные заболевания, чаще • выявляются у детей. • Синдром Луизы –Бар: атаксия (расстройство координации произвольных движений )+ телеангиоэктазии (локальное расширение капилляров и мелких концевых артерий)+ участки ди- и гиперпигментации; • Синдром Вискотта-Олдрича: геморрагии +экзема+тромбоцитопения. • синдром Ди Джорджи: судороги+пороки развития лицевого скелета и сердечно-сосудистой системы +гипоплазия тимуса.

Вторичные иммунодефициты • НАЛИЧИЕ ХРОНИЧЕСКИХ ИЛИ ЧАСТО ВОЗНИКАЮЩИХ ИНФЕКЦИЙ (ОСОБЕННО ВЫЗВАННЫХ УСЛОВНО ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРОЙ) • АЛОПЕЦИЯ , ДЕ- И ГИПЕРПИГМЕНТАЦИЯ КОЖИ • САРКОМА КАПОШИ

ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ СИНДРОМ • УВЕЛИЧЕНИЕ МНОГИХ ГРУПП ЛУ (ОНИ МОГУТ БЫТЬ СПАЯННЫМИ И НЕСПАЯННЫМИ С ОКРУЖАЮЩИМИ ТКАНЯМИ ) • ХАРАКТЕРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ОБЩЕМ АНАЛИЗЕ КРОВИ (УВЕЛИЧЕНИЕ КОЛ-ВА ЛЦ. , ПОЯВЛЕНИЕ БЛАСТОВ, МАЛОДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК) • СПЛЕНОМЕГАЛИЯ (УВЕЛИЧЕНИЕ СЕЛЕЗЕНКИ). • ЧАСТЫЕ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ

ЛЕЙКОЦИТЫ НОРМА И ПРИЧИНЫ ОТКЛОНЕНИЯ ОТ НЕЕ. ЛЕЙКОЦИТАРНАЯ ФОРМУЛА Увеличение показателя (лейкоцитоз): • Бактериальная, вирусная, грибковая инфекции; • Злокачественные новообразования; • Лейкозы; • Действие стероидных гормонов;

Снижение показателя (лимфопения): • Гипо- и аплазия костного мозга, повреждение его химическими веществами, ионизирующим излучением; • Гиперспленизм (увеличение селезенки); • Острые лейкозы; • Плазмоцитома (опухоли из плазмацитов); • Метастазы, новообразования в костный мозг; • Некоторые инфекции: тиф, корь, краснуха, ветряная оспа, сальмонелез, инфекционный мононуклеоз; • Действие лекарств: сульфаниламиды, некоторые антибиотики, нестероидные противовоспалительные препараты, противоэпилептические препараты;

Определение уровня иммуноглобулинов Увеличение концентрации Ig. А, Ig. М, Ig. G: • Острые, хронические, бактериальные, грибковые и паразитарные инфекции; • Хронические заболевания печени; • Системные заболевания соединительной ткани; • Хронический лимфолейкоз; • Миеломная болезнь; • Макроглобулинемия Вальденстрема

Снижение концентрации Ig. А, Ig. М, Ig. G: • Врожденная а- или гипогаммаглобулинемия (снижение или отсутствие синтеза антител); • Новообразования иммунной системы; • Удаленная селезенка; • Потеря белка при заболеваниях почек или кишечника; • Лечение цитостатиками или иммунодепрессантами; • Действие ионизирующего излучения; • Острая вирусная инфекция для Ig. A и хроническая для Ig. M и Ig. G.

Иммуноанализами называют такие методы, в основе которых лежит взаимодействия антиген-антитело, которые определяются с помощью специальных меток заранее конъюгированных с антигеном или антителом. Используют следующие виды меток: 1. Радионулиды (Н 3 – уридин, Н 3 – тимидин); 2. Ферменты (пероксидаза хрена и др. ); 3. Люминесцентные или флюоресцентные вещества (люминол, флюорисцин изоцианата и др. ).

Объекты исследования в клинической иммунолгии: 1. Периферическая кровь (клетки, сыворотка, плазма); 2. Биологические жидкости (слюна, слезы, бронхоальвеолярная жидкость и др. ); 3. Гистологический анализ (иммуногистохимия); 4. Генотипирование (ПЦР, ПЦР в реальном времени). 5. Супернатант с культивируемых in vitro клеток

Выделение мононуклеарных клеток на градиенте плотности фиколл-изопак p=1, 077

Разделение клеток на иммуномагнитных гранулах 1. Гранулы покрывают моноклональными антителами к антигену, выделяемых клеток. 2. Гранулы инкубируют с клеточной суспензией (или цельной кровью) 3. Клетки, связавшиеся с антителами, фиксированными на гранулах иммобилизуются в пробирке с помощью магнитного поля. 4. Не иммобилизированные клетки удаляют из пробирки. 5. Клетки получают после отмывания и диссоциации от покрытых антителами гранул.

Метод проточной цитометрии позвол ляет регистрировать с помощью лазерного луча параметры клеток. 1. Клетки обрабатывают моноклональными антителами с флюоресцентными красителями и пропускают через капилляр. 2. Лазерный луч с помощью детекторов определяет размеры (по светорассеянию) и гранулярность (поперечное светорассеяние) клеток 3. В соответствии с измеряемыми параметрами клеточные популяции можно разделить на субпопуляции. 4. Параметры регистрируются автоматически и подвергаются компьютерной обработке в виде графиков.

Иммунофлюоресценция: иммуноглобулины в цитоплазме плазматических клеток Фиксированные плазматические клетки человека окрашены меченным флюоресциином антителами к Ig. M (зеленое свечение) и меченными родомином антителами к Ig. G (красное свечение)

Оценку иммунного статуса можно проводить несколькими способами: 1. По тестам I уровня (ориентировочные, можно провести практически в любой лаборатории); 2. По тестам II уровня (аналитические тесты, используют для углубленного анализа); 3. Патогенетический принцип: оценка отдельных звеньев иммунной системы (распознавание, активация, пролиферация, дифференцировка и регуляция); 4. Оценка состояния врожденного иммунитета (клеток и гуморальных факторов); 5. Оценка состояния адаптивного или приобретенного иммунитета (Т и В – лимфоциты и их субпопуляции).

Тесты I уровня • Исследование должно начинаться с определения количества основных клеточных популяций крови(анализ крови): – количество лейкоцитов (абсолютное и относительное); – количество Т-лимфоцитов (CD 3); – количество В-лимфоцитов (CD 19); – фагоцитоз (фагоцитарное число и фагоцитарный индекс). • количество иммуноглобулинов (Ig. M, Ig. A, Ig. G); . Анализ на ВИЧ- инфекцию Тесты I уровня назначаются при подозрении на наличие иммунодефицитов, аутоиммунных, аллергических заболеваний при хронических инфекционных заболеваниях и злокачественных новообразованиях, при обследовании реципиентов до и после аллотрансплантации органов тканей.

Реакция пеципитации в геле: двойная иммунодиффузия.

Простая радиальная иммунодиффузия. Дает возможность количественно определять содержание антигенов или антител в сыворотке крови человека.

Тесты II уровня назначаются для уточнения нарушений в функционировании иммунной системы. Важно оценивать данные иммунограммы в комплексе с клинической картиной и данными анамнеза. • Определение субпопуляции Т-лимфоцитов Th 1, Th 2, Th 17, Treg. По маркерам и внутреннему содержанию и выработке цитокинов (ИФН-y, ИЛ-4, ТФР-в) методом проточной цитометрии. • Оценка активности киллерных клеток (ЦТЛ, NK, и др. с определением гранзимов перфорина или выходу радиоактивной метки) • Определение специфических Ig Е (ИФА); • Оценка пролиферативной активности Т-и-В лимфоцитов на митогены, антигены, аллогенные клетки. (РБТЛ). • Экспрессия активационных маркеров (CD 25, CD 69, CD 71, HLA-DR). • Определение различных компонентов комплемента (Манчини, Рокет-ИФА). • Оценка различных этапов фагоцитоза и рецепторного аппарата фагоцитов (Н 2 O 2. О 2 - NВТ-нитросинего тетразоля) • Определение продукции цитокинов (экспрессия рецепторов идр. ). • Анализ генов. Ответственных за экспрессию иммунологически значимых молекул (ПЦР). • Подавление миграции лейкоцитов in vitro в присутствии митогена или специфического для Т-лимфоцитов антигена (МИФ). Комплекс тестов второго уровня может значительно варьировать в зависимости от поставленных врачом задач.

Иммуноэлектрофорез Позволяет разделять сложные смеси антигенов, содержащихся в сыворотке крови. Разделение осуществляют в агаровом геле, помещенном в электрическое поле. Положительно заряженные белки перемещаются к катоду, а отрицательно заряженные к аноду. Затем между лунками вырезают канавку, которую заполняют раствором антител. Антигены и антитела формируют дуги преципитации.

В электрическом поле антигены (+) и антитела (-) движутся навстречу другу и преципитируют. Ракетный электрофорез позволяет количественно определять антиген в антителосодержащем геле. Длина линии преципитации пропорционально концентрации антигена.

Тесты оценки иммунного статуса по патогенетическому принципу I. Распознаванание – Оценка Т-клеточного рецептора (TCR); – Адгезивные молекулы (интегрины и др. ); – Смешанная культура лимфоцитов; – Генный анализ аллотипов HLA и TCR; – Распознавание цитотоксическими CD 8 лимфоцитами антигенов вирусов, опухолевых клеток и др. II. Активация – Фенотипирование маркеров активации (CD 25, CD 71, HLA- DR и др. ) при стимуляции ФГА, антителами к TCR и CD 2; – Выявление маркеров в крови без стимуляции с использованием двойной метки CD 4+CD 25+; – Выявление вторичных мессенджерова (с. АМР, с. АТР, протеинкиназы и др. ); – Отвечаемость на цитокины (экспрессия рецепторов цитокинов);

III. Пролиферация – Бласттрансформация лимфоцитов на митогены, специфические антигены; – Ответ на факторы роста клеток; IV. Дифференцировка (эффекторная функция) – Продукция иммуноглобулинов; – Цитотоксическая функция Т-клеток (CD 8); – Оценка естественных киллеров (NK-клеток); – Продукция цитокинов; V. Регуляция – Оценка хелперных и супрессорных функций лимфоцитов; – Анализ функциональных свойств Т-хелперов первого и второго типов и продуцируемых ими цитокинов (ИНФγ, ИЛ 4); – Оценка регуляторных свойств моноцитов;

Методы оценки цитотоксических клеток • Механизм цитолиза , осуществляемого NК киллерами и цитотоксическими Т- лф, практически идентичны. Характер цитолиза предполагает значительную роль молекул адгезии в установлении контакта между клетками-киллерами и мишенями LFA-1 и ICAM-1. и перфорингранзимный механизм, служащими основными инструментом цитолиза (NK-клетки) CD 8+ лимфоциты используют Fas-Fas. L. • NK-клетки оценивают по способности лизировать трансформированные клетки, предварительно меченные флуорохромами или радионуклеидами. • В качестве клеток-мишеней и пользуются клетки линии эритромиелоидного лейкоза человека К-562, которые предварительно (за 6 часов до конца инкубации) метят 51 Cr или Н 3 -уридин. • Реакцию ставят в круглодонных планшетах, соотношение эффектор-мишень обычно варьирует от 20: 1 до 1; 1 • После инкубации (60 мин при 37 о. С) клеток-мишеней с киллерами собирают надосадок без клеток в пробирки для Y-счетчика. • Мерой лизиса клеток служит выход радиоактивной метки в супернатант • Рассчитывают процент метки, освободившейся из клеток по формуле: • Индекс цитотоксичности (Эксп. -Спонт. /Макс. – Спонт. )Радиоактивность опытных проб / спонтанная. Максимальная- в положительном контроле ( 100% лизис при обработке 2, 5 %раствором тритона Х-100)

Определение цитолитических CD 8+ Т-клеток • Метод оценки цитотоксических CD 8+клеток по выявлению мембранной экспрессии молекул CD 107 (LAMP-1), которые являются специфическим маркером гранул гранзима-перфорина. • В норме эта молекула отсутствует на клеточной поверхности, но содержится на мембранах лизосом. При активации специфическим антигеном происходит быстрая дегрануляция цитотоксических гранул слияние с цитоплазматической мембраной на поверхности клеток. • Дегранулировавшие CD 8+ клетки выявляют с помощью поверхностной иммунофлуоресцентной окраски на CD 107 а на проточной цитометрии. • Этот метод позволяет выявлять именно цитолитические АГ- специфические CD 8+ Т –клетки. • Метод может применяться в сочетании с внутриклеточной окраской на IFNy для оценки содержания АГ-специфичных CD 8+ Т-клеток памяти, не обладающих немедленной цитолитической функцией • )

• Метод измерения пролиферативного ответа лимфоцитов с помощью моноклональных антител с CD 3 и костимулирующей молекуле CD 28. м. АТ к CD 3, фиксируют на пластике в сочетании с растворимыми антителами к молекуле CD 28, что вызывает поликлональный ответ лф. (вместо митогенов). Добавляют лимфоциты от больного и культивируют 24 -48 часов при 37 о С. Оценивают по включению Н 3 -тимидина в пролиферирующие клетки ( на радиоактивном счетчике). • Функцию Тх1 и Тх2 определяю по синтезу ИНФy и ИЛ-4 на проточном цитофлуориметре. Для этого лф. стимулируют ФМА (активатор РКС) и иономицином (кальциевый ионофор). Клетки обрабатывают брефельдином А, блокирующим синтез, затем обрабатывают сапонином (нарушает клет. мембрану) и инкубируют с моно. АТ к цитокинам, меченными флуорохромом.

Апоптоз • Оценка клеток, вступивших в апоптоз методом проточной цитофлуорометрии • ( связывания анексина V, меченного флуорохромом с фосфатидилсерином, который появляется на поверхности клетки только при апоптозе).

Определение специфических CD 8+ Т-лимфоцитов с использованием МНС-тетрамеров • Антигенный пептид даже в комплексе с МНС, обладает очень низкой аффинностью к ТCR Т-лф. , в связи с этим необходимы подходы, которые помогли бы выявлять специфические цитотоксические Т-лф. • Решение было достигнуто путем создания тетрамеров биотилированных комплексов МНС-пептид • Создают тетрамер молекулы МНС-1 (ПЦР) • Добавляют специфический антиген(пептид). • К МНС-пептидному комплексу добавляют фермент (Bir A –лигаза) и биотин и др. Смесь инкубируют для создания биотилированного комплекса. , к которому хорошо присоединяется авидин (или стрептавидин), меченный флуорохромом (фикоэритрин). К каждой молекуле авидина присоединяется 4 молекулы комплекса МНС- пептид. • СD 8+лф. инкубируют с МНС-пептидом, добавляют м. АТк СD 8+. • Клетки анализируют на проточном цитофлуориметре. Определяют • Одновременно экспрессию меченных тетрамеров и CD 8.

Оценка функции естественных регуляторных клеток • Регуляторные клетки (CD 4+ CD 25+) инкубируют с магнитными бусами нагруженными антителами (CD 14, CD 56, CD 19, CD 8, CD 54 RA(рец. для LFA-1), CD 235(гликофорин к мембранам эритроцитов). • Несвязавшиеся клетки CD 4 +CD 25+ смешивают с бусами, нагруженными антителами с CD 25+ • Несвязавшиеся CD 4+CD 25 -клетки используют для постановки функционального теста: активируют моноклональными антителами к CD 3, CD 28 и IL-2 и добавляют АПК • CD 4+CD 25 - CD 4+CD 25+ клетки культивируют в 96 -луночных планшетах порознь. • За 18 часов до окончания культивирования добавляли 3 Н-тимидин • оценивают индекс стимуляции и подавления стимуляции (отношение вкл. 3 Н-тимидина в культуре CD 4+ CD 25 - и CD 4+CD 25+) •

Оценка внутриклеточного киллинга бактерий • Для исследований используют ФИТЦ-меченый стафилококк (St. aureus), который добавляют к лейкоцитам крови человека в соотношении 1: 5. ( Удаляют несвязавшиеся бактерии центрифугированием с осаждением лейкоцитов и отмыванием ФСБ) • Инкубируют 20 мин при 37 С в 96 луночных круглодонных планшетах • Лейкоциты осаждают и ресуспендируют в 2% растворе сапонина в буфере (р. Н 9, 5). • Высвободившиеся бактерии осаждают центрифугированием и ресуспендируют в ФСБ с пропидиумом иодида ( убитые бактерии позитивны по ПИ) • С помощью проточного цитометра оценивают процент двойных позитивных бактерий (ФИТЦ+ ПИ+) среди ФИТЦ- меченых бактерий

• Современные методы оценки фагоцитоза основаны на проточной цитометрии с применением объектов фагоцитоза (бактерий, частиц и др. ), меченных флуорохромам. • К лейкоцитам крови человека добавляют ФИТЦ-меченный стафилококк в соотношении 1: 5 в объеме 200 мкл в 96 луночных круглодонных планшетах. • Суспензию инкубируют 30 мин. При 37 С. • После инкубации клетки поглотившие бактерии, осаждают центрифугированием. • Лейкоциты ресуспензируют 200 мкл 2% раствора параформальдегида и анализуруют на проточном цитометре. • Оценивают процент клеток среди гранулоцитов и моноцитов положительных по зеленой флуоресценции соответствующей ФИТЦ -меченым бактериям.

Оценка врожденного иммунитета • Клетки врожденного иммунитета содержат рецепторы – PPR (pattern recognition receptors). Выявлено три группы рецепторов: TLR (включает 11 рец. ), NOD (8 рец. ), Rig (3 рец. ). • Внеклеточные TLR 2 и TLR 4 распознают пептидогликан клеточной стенки бактерий и ЛПС грамотрицательных бактерий; внутриклеточные TLR 3, 7. 8 – вирусные нукл. к-ты, TLR 9 -Cp. G-мотив бактериальной ДНК. С помощью м. АТ и проточной цитометрии можно оценить интенсивной экспрессии рецепторов. Если мц крови человека, стимулированные ЛПС, синтезируют TNF-a в количествах , соотв. норме, то можно говорить о норм. экспрессии рец. TLR 4.

Оценка экспрессии TLR 4 на поверхности CD 14+ моноцитов ДОНОР Больной ОВИН TLR 4 PE-Cy 5 TLR 4 PE Cy 5