КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ Стратегия направленная на

КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ

КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ Стратегия, направленная на замещение, восстановление или улучшение биологической функции поврежденных органов или тканей с помощью введения аутологичных или аллогенных клеток Данная стратегия может использовать как дифференцированные (специализированные) клетки, так и клетки, способные к специализации в различных направлениях (стволовые клетки) В настоящий момент разрешено для клинического применения только 2 подхода: трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при лейкемиях, а также эквиваленты кожи и роговицы

ПРЕПАРАТОВ Дифференцированные клетки взрослых тканей (фибробласты кожи, гепатоциты, клетки мононуклеарной фракции крови) Стволовые клетки Эмбриональные Клетки внутренней массы бластоцисты (ЭКО) Тканеспецифичные прогениторные клетки плода (аборты после 20 недели) Соматические (аутологичные и аллогенные) циркулирующие в крови; из костного мозга (мезенхимальные и гемопоэтические); стромальные из жировой ткани; миобласты скелетных мышц; другие региональные предшественники (ольфакторный эпителий) Индуцированные плюрипотентные клетки

Механизмы действия клеточных препаратов • Тканезамещение (формирование ткани de novo введенными клетками) • Секреция факторов роста • стимуляция трофики • подавление апоптоза • активация резидентных стволовых клеток • продукция микровезикул

Стволовые клетки опосредуют регенерацию тканей Figure 21 -1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

История открытия стволовых клеток 1909 – гемопоэтические стволовые клетки Maximow A. A. Folia Haematologica. 1909. 8: 125— 134. Cтволовые клетки во взрослом организме открыты в 1909 году 1968 – мезенхимальные стволовые клетки Friedenstein A. J. et al. Transplantation. 1968. 6 (2): 230– 47. Александрович Максимов (1874, Санкт-Петербург – 1928, Чикаго) 1998 – эмбриональные стволовые клетки человека Thomson J. A. et al. Science. 1998. 282: 1145 -1147. Oct 4 Sox 2 Lin 28 c-Myc Nanog Klf 4 2006 – индуцированные плюрипотентные клетки Takahashi K, Yamanaka S. Cell. 2006. 126(4): 663 -76.

Стволовые клетки – это клетки, способные к самообновлению посредством деления и к дифференцировке в специализированные клетки тотипотентные Эмбриональные стволовые клетки (плюрипотентные) Все ткани организма содержат стволовые клетки Тканеспецифичные стволовые клетки (мультипотентные)

Индуцированные плюрипотентные клетки способны дифференцироваться в различные типы клеток Nanog Oct 4 Sox 2 Lin 28 c-Myc Klf 4 дифференцировка яйцеклетки сперматозоиды печень легкие кишечный эпителий кардиомиоциты ГМК эндотелий DOPA- нейроны лимфоциты двигательные нейроны

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА СОПРОВОЖДАЕТСЯ СНИЖЕНИЕМ ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ И ИЗМЕНЕНИЕМ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОГО СТАТУСА (Waddington, 1957).

ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ КЛЕТКИ Эмбриональные Аутологичные соматические Аутологичны е ИП-клетки Доступность нет да да Дифференцировка in vivo да с ограничениями да да, тератомы ? да, тератомы Секреторная активность да да - Перенос инфекций да нет Иммунологическая совместимость нет да да Вероятность трансформации после трансплантации

КЛЕТКИ-ПРЕДШЕСТВЕННИКИ РАСПОЛАГАЮТСЯ В «НИШАХ» Ниша - физиологически ограниченное микроокружение, в котором располагаются стволовые клетки (Schofield, 1978) Состоит из поддерживающих клеток (в костном мозге - остеобласты или эндотелий) Поддерживает баланс между самообновлением и дифференцировкой Защищает от неблагоприятных воздействий

Примеры ниш Стволовая клетка Расположение Клетки «ниши» Гемопоэтическая СК Эндостель; рядом с Остеобласты, кровеносными сосудами остеокласты, (в их стенке) мезенхимальные клетки, эндотелий СК скелетных мышц Под базальной пластинкой на мышечном волокне Мышечные волокна? Нейральные СК Субвентрикулярная зона Эндотелий СК кишечного эпителия Дно крипты Фибробласты? Клетки Панета? СК эпидермиса Клетки сосудистой стенки? Волосяная сумка адапт. из Morrison and Spradling. Cell 132, 598– 611, February 22, 2008

Гетерогенность МСК in vitro • В гетеротопических трансплантатах костного мозга были обнаружены очаги остео-, хондро- и адипогенной дифференцировки • In vitro обнаружены клетки, дающие КОЕ-Ф и способные к остео-, хондро- и адипогенной дифференцировке • На основании анализа клоногенной и дифференцировочной способностей субпопуляций МСК были выбраны маркеры [CD 73/CD 105/CD 90 (Cytotherapy, 2006); CD 56/CD 271/MSCA-1 (Hematologica, 2009) или PDGFRalpha/Sca-1 (JEM, 2009)] • Культивируемые МСК гетерогенны по морфологии, пролиферативной активности, дифференцировочным способностям in vitro, способности к остеогенезу in vivo

Схема ниши для ГСК в костном мозге

Схема ниши для СК в скелетной мышце

МОБИЛИЗАЦИЯ Активация резидентных стволовых клеток: открепление от ниши, пролиферация, дифференцировка, выход из депо (направленная миграция) Происходит под действием цитокинов, гормонов, гипоксии, физической нагрузки, терапии лекарственными препаратами (статинами, ингибиторами АТ 1), воспаления, травмы

Для восстановления необходима мобилизация клеток-предшественников Мобилизация Адгезия Миграция по градиенту хемоаттрактанта Костный мозг Дифференцировка

МОБИЛИЗАЦИЯ ГЕМАТОПОЭТИЧЕСКИХ СК ПОД ДЕЙСТВИЕМ G-CSF Подавление SDF-1 на остеобластах и его повышение в крови: открепление от ниши Индукция протеолитических ферментов (эластазы, катепсина G, ММР-2 и ММР-9): трансэндотелиальная миграция, расщепление

Эффективность Индукция воспаления Факторы, мобилизующие ГСК из костного мозга Костный мозг GM-CSF G-CSF HMGB 1 VEGF SDF-1 эритропоэтин ангиопоэтин-1 Статины Нагрузка эстроген

Источники факторов, мобилизующих ГСК из костного мозга

ХОМИНГ И ИНТЕРСТИЦИАЛЬНАЯ МИГРАЦИЯ Хоминг – процесс распределения клеток по тканям организма с током крови до распознавания и взаимодействия с микрососудистым эндотелием в участкемишени Интерстициальная миграция – активное амебоидное движение клеток под действием экстраваскулярных направляющих факторов, не зависит от тока крови

Хемоаттрактанты для СК

Адгезия СК

Адгезия и инвазия изменение конформации и поляризация 1 и 2 интегринов PSGL-1 Е-селектин катепсин L Р-селектин VEGF SDF-1 HMGB 1 некроз воспаление ишемия

АДГЕЗИЯ К КОМПОНЕНТАМ МАТРИКСА Фибрин (васкуляризация тромбов) Коллаген I и IV Фибронектин Ламинин

МОБИЛИЗАЦИЯ VS. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ Трансплантация Мобилизация Инвазивность Да, для аутологичных Нет Использование специфичного типа клеток Да Нет Необходимость выделения клеток из тканей Да Нет Наращивание клеток в культуре: Да Нет Выживание после введения в ткань ? N/A -Возможность многократного умножения -Риск передачи инфекций -Риск накопления геномных аберраций

СЕКРЕЦИИ МСК факторы роста хемокины цитокины биоактивные липиды Эндотелий Нервные окончания Дифференцированные клетки Иммунные клетки Тканеспецифичные СК Циркулирующие СК микро. РНК

ПОВРЕЖДЕНИЕ ВЫЗЫВАЕТ ВЫБРОС МИКРОВЕЗИКУЛ, ВЛИЯЮЩИХ НА СК

СК продуцируют микровезикулы, стимулирующие репарацию

КЛЕТКИ, ПРЕДЛАГАЕМЫЕ ДЛЯ ТЕРАПИИ Эмбриональны е Соматические Аллогенные Аутологичные Аллогенные Доступность нет да да Дифференцировка in vitro да Да, с ограничениям и Дифференцировка in vivo да, тератомы ? ? Секреторная активность да да да Перенос инфекций да да нет Иммунологическая совместимость нет да

Получение клеточных препаратов Выделение клеток из ткани Экспланты (только культивирование) Ферментативная обработка Центрифугирование Очистка (обогащение) Иммуносортинг Селективная адгезия Селективные среды культивирования Культивирование

ПРЕПАРАТОВ Источник (аллогенный или аутологичный) Дифференцировочный мультипотентные) Область потенциал (уни- или применения Выживание после трансплантации Интеграция в ткани

Выделение фибробластов дермы из биоптатов кожи биоптат 3 х3 мм Ферментативная обработка Осаждение Культивирование Через 2 недели культивирования Маркерный антиген фибробластов CD 90 (красная флуоресценция). Эластин (зеленая флуоресценция). Ядра окрашены DAPI (синяя флуоресценция)

ПРЕПАРАТЫ АУТОЛОГИЧНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ КОЖИ Заживление ран Лечение ожогов Лечение трофических язв Лечение возрастных изменений кожи, атрофических рубцов

Выделение клеток из жировой ткани Жировая ткань Ферментативная обработка Разделение на фракции Лизис эритроцитов в осадке Осадочная фракция: клетки стромы, сосудов, лейкоциты, эритроциты Фильтрация Осаждение Культивирование через 5 дней после выделения

СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ Лечение пародонтита (пародонтоза) Стимуляция ангиогенеза в ишемизированных тканях Восстановление периферических нервов при травмах и ЦНС при нейродегенеративных заболеваниях Лечение стрессового недержания мочи и обратного заброса мочи у женщин Лечение свищей и фистул в проктологии Восстановление костных дефектов Введение в кожу при истонченном фенотипе и недостаточном слое подкожной жировой клетчатки

Выделение ГСК и МСК из крови и костного мозга аспират мононуклеарная фракция Кровь Дифференцировка в микромассе в хондроциты Культивирование (МСК)

ПРЕПАРАТЫ ГСК Лейкемии Аутоиммунные Заменители тромбоциты) заболевания крови (эритроциты,

Выделение клеток-предшественников из аневризмы сердца Ферментативная обработка Иммуномагнитная селекция c-kit+ клеток Осаждение - с-kit+ клетки-предшественники Маркеры клеток-предшественников Предшественники эндотелия (CD 105) Малодифференцированные клетки (c-kit+) Культивирование

Иммуноселекция: сортировка в потоке сигнал на ФЭУ лазеры + -

Иммуномагнитная селекция Мечение антителами, конъюгированным и с магнитными микрочастицами Помеченные клетки остаются на магните в электромагнитном поле, удаляются негативные клетки Помеченные клетки можно смыть с колонки после снятия электромагнитного поля

Ближайшие перспективы применения СК в медицине На пленках и носителях для лечения язв, восстановления костной ткани Раневые повязки протезов сосудов Восстановление кровоснабжения ишемизированных тканей

ОГРАНИЧЕНИЯ В ПРИМЕНЕНИИ ПРЕПАРАТОВ КЛЕТОК Иммунологическая совместимость Нежелательный рост (трансформация) Время жизни трансплантированных клеток в ткани-мишени Перенос инфекций Сохранение свойств после длительного культивирования

ПАСПОРТ КЛЕТОЧНОГО ПРЕПАРАТА Тип клеток Происхождение образца Маркировка образца Результаты исследований на инфекционные агенты и аутоиммунные заболевания до взятия биопсии: Антиядерные антитела Антитела к нативной ДНК Антитела к фосфолипидам Ig. M Антитела к фосфолипидам Ig. G Сифилис EIA (ИФА) Ig G/Ig. M (антитела к антигенам Treponema pallidum Ig. G /Ig. M, anti. Treponema pallidum Ig. G /Ig. M, Syphilis TPEIA) Цитомегаловирус, определение ДНК (Cytomegalovirus, CMV DNA) Вирус гепатита В – Hbs. Ag ( «австралийский» антиген). Вирус гепатита В, определение ДНК (качественное) (HBV-DNA). Вирус гепатита С – anti HCV total Микоплазма (Mycoplasma pneumonia), определение ДНК Характеристики образца: Номер пассажа Жизнеспособность клеток % на момент выдачи образца Цвет, консистенция образца р. Н Стерильность К-во флаконов данного образца Объем в каждом флаконе Концентрация клеток число/мл Условия хранения Дата и время выдачи образца Результаты исследований на инфекционные агенты в клеточном образце при выдаче Цитомегаловирус, определение ДНК (Cytomegalovirus, CMV DNA) Микоплазма (Mycoplasma pneumonia), определение ДНК Анализ на стерильность

Nes-GFP 1 cells are perivascular stromal cells targeted by the SNS, express high levels of Cxcl 12 and are physically associated with HSCs Нестин CD 31 Нестин Тирозин-гидроксилаза 4 -week primary myeloid culture

Дифференцировочный потенциал клонов МСК различается

МСК репопулируют костный мозг реципиента

MSCs self-renew, differentiate and transfer haematopoietic activity in vivo

Гетерогенность in vivo: МСК = перицит? артериолы капилляры адвентиция Corseli M. , ATVB. 2010; 30: 1104 -09 • Клетки, несущие маркеры МСК (Stro-1, SSEA-3, CD 34, CD 156 обнаружены в стенке кровеносных сосудов) • Клетки, несущие маркеры перицитов, обладают клоногенной и дифференцировочной способностями МСК in vitro • Перициты in vivo несут маркерные антигены МСК

Nes-GFP 1 cells are mesenchymal stem cells

• Клетки, несущие маркеры МСК, могут быть выделены практически любых тканей организма • In vitro клоны МСК отличаются по пролиферативной активности и дифференцировочной способности • In vivo располагаются преимущественно периэндотелиально • Образуют синаптические контакты с аксонами • Являются компонентом ниш тканеспецифичных СК • Гетерогенность и функции in vivo остаются не известными