Клеточная стенка прокариот Цитология микроорганизмов Прокариоты лишенные

Клеточная стенка прокариот Цитология микроорганизмов

Прокариоты, лишенные клеточной стенки Thermoplasma acidophilum Представители микоплазм

Дифференцировка прокариот методом Грама 1884 г. датский ученый Ганс Кристиан Йоахим Грам Основной краситель: кристаллический фиолетовый Фиксатор: раствор йода Дополнительный краситель: фуксин Грамотрицательные эубактерии Компоненты клеточной стенки Грамположительные эубактерии Пептидогликан внутренний слой (пептидогликановый) внешний слой (наружная клеточная мембрана) + + – Тейхоевые кислоты + – – Полисахариды + – + Белки ± – + Липиды ± – + Липополисахариды – – + Липопротеины – ± + Обозначения: (–) — отсутствуют, (+) — присутствуют, (±) — присутствуют не у всех видов

Клеточная стенка как хемотаксономический маркер Пептидогликан и его компоненты Тейхоевые и тейхуроновые кислоты Липополисахарид ы Белки S-слоя Белки и гликопротеины псевдомуреина архей

Структура повторяющейся единицы пептидогликана клеточной стенки бактерий Цифры в кружках обозначают: 1, 2 - места полимеризации гликанового остова молекулы; 3 - место присоединения с помощью фосфодиэфирной связи молекулы тейхоевой кислоты в клеточной стенке грамположительных эубактерий; 4, 5 - места, по которым происходит связывание между гликановыми цепями с помощью пептидных связей; 6 - место ковалентного связывания (пептидная связь) с липопротеином наружной мембраны у грамотрицательных эубактерий; 7 - место действия лизоцима.

Пространственная организация пептидогликана N-ацетилглюкозамин N-ацетилмурамовая кислота Олигопептиды

Синтез пептидогликана сборка перенос полимеризация UDP - уридиндифосфат; PEP - фосфоенолпируват; - N-ацетилглюкозоамин; - N-ацетилмурамовая кислота. цитоплазма мембрана периплазм

Клеточная стенка грамположительных бактерий пептидогликан цитоплазматическая мембрана белки тейхоевые к-ты липотейхоевые к-ты пептидогликан ЦПМ фосфолипиды

Структура пептидогликана грамположительных бактерий N-ацетилглюкозамин (NAG) N-ацетилмурамовая кислота (NAM) Цепь тетрапептида Связующий пептид Аминокислоты боковой цепи Поперечные аминокислоты Пептидная связь Углеводный остов

Клеточная стенка Группы пептидогликанов грамположительных бактерий: Аминокислота в положении 3' аминокислотной цепи, Положение межпептидного мостика (3' - 4' или 2' - 4'), Состав межпептидного мостика

Тейхоевые кислоты Представляют собой полимеры глицеролфосфата или рибитолфосфата n n ундекапренилфосфат N-ацетилглюкозамин N-ацетилмурамовая кислота P глицеролфосфат рибитолфосфат CMP аминокислоты CMP CDP P фосфат

Отличия липотейхоевых кислот Представляют собой полимеры 1, 3 -глицеролфосфата , связанного с 1, 3 -диацилглицеролом Синтез: две молекулы глюкозы переносятся на диацилглицерол. Далее на него переносится глицеролфосфат с фосфатидилглицерола

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий наружняя мембрана пептидогликан цитоплазматическая мембрана цитоплазма белок порин О-полисахарид Липид А наружняя мембрана липопротеин пептидогликан ЦПМ фосфолипиды

Липополисахарид ЛПС можно разделить на 3 фрагмента: Липид А является эндотоксином и содержит 2 ацилированных , остатка глюкозо-N-ацетилфосфата Сердцевинный компонент состоит из кето-дезоксиоктоновой к-ты, гептоз и нейтральных сахаров, например галактозы. Наружная О-цепочка (О-АГ) состоит из последовательностей сахаров (от 2 до 8) повторяющихся многократно.

Сборка ЛПС О-полисахарид-P-P-undec + олигосахарид-Kdo-липид А = ЛПС Процесс катализируется лигазой (Rfa. L/Rfa. T)

Порины Специфические – за перенос определенных субстратов (фосфат – Pho. E) Общие – за перенос мелких молекул (Omp. C, Omp. F)

Некоторые дифференцирующие признаки основных категорий бактерий Признак Основная категория II Цитологические признаки -окраска по Граму -наличие наружной мембраны -кислотоустойчивое окрашивание -образование эндоспор -рост в виде нитей, состоящих из гиф с истинным ветвлением + D - + D D D Движение -встречается скользящее движение D - 11 -22% + D <10% D <4% D >10% D D - Химические признаки -процентное содержание липидов -присутствие тейхоевых или липотейхоевых кислот -липополисахариды -присутствие 2 -кето-3 -дозоксиоктоната -содержание пептидогликана -присутствие миколовых кислот -присутствие фосфатидилинозитол манноззидов -фосфосфинголипиды Метаболические признаки -получение энергии за счет окисления железа, серы, соединений азота Обозначения: «+» – положительные, «-» – отрицательные, «D» – различные

Грамположительные и грамотрицательные бактерии Грамположительные Цитоплазматическая мембрана Периплазматическое пространство Пептидогликан Наружная мембрана (липополисахариды и белки) Грамотрицательные

Клеточные стенки архей и бактерий Грамположительная Бактериальный тип Архейный тип Грамотрицательная

Клеточная стенка Муреиновый тип пептидогликана: NAG + NAM Наибольшее разнообразие межпептидного хвоста у грамположительных бактерий У архей псевдомуреиновый тип пептидогликана: NAG + NATAU NAGal + NATAU

Клеточные стенки архей и бактерий Группы прокариот Археи Псевдомуреин Пептидогликановые гетерополимеры их клеточных стенок Бактерии Муреин Структурные элементы гликановой составляющей N-ацетилглюкозамин и N-ацетилталозаминуроновая кислота N-ацетилглюкозамин и N-ацетилмурамовая кислота Характер связи между сахарными остатками β-1, 3 -гликозидная β-1, 4 -гликозидная аланин, глутаминовая кислота, лизин - аланин, лизин Структурные элементы пептидной составляющей: L-аминокислоты D-аминокислоты особые диаминокислоты, не встречающиеся в составе белков аланин, глутаминовая кислота мезо-диаминопимелиновая и диаминомасляная кислота

Клеточная стенка микобактерий Капсуло-подобный материал Слой миколиевых кислот Вставочные липиды Липоарабиноманнан Маннозная головка Арабиноза Арабиногалактан Галактоза Арабиноза Маннозное ядро Пептидогликан Мембрана Белки N-ацилмурамовая кислота Манноза Арабиноза N-ацетилглюкозамин Галактоза L-рамноза Якорь фосфотидилиноситола

Миколовые кислоты Различаются по длине, числу двойных связей, заместителей.

Основные этапы окраски по Граму крист. фиолетовый йод спирт фуксин 1 Добавление кристаллического фиолетового 2 Добавление йода 3 Отмывка спиртом 4 Добавление фуксина

Основной краситель – генциан фиолетовый CV+ CV Cl-

Протравитель – раствор йода CV+ I

Обесцвечивание – отмывка этанолом CV-I Этанол

Вымывание основного красителя у грамотрицательных бактерий CV-I

Дополнительный краситель – фуксин CV-I Фуксин

Результат окраски по Граму CV-I Фуксин

Способы фиксации Физический способ фиксации: Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2— 3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1: 1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10— 15 минут и затем высушивают на воздухе.

Методика окраски по Граму • На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2— 3 минуты. • Сливают краску. Мазок заливают на 1— 2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму на 1— 2 минуты до почернения препарата. • Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, пока и мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20— 40— 60 секунд). • Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1— 2 мин. • Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2— 5 мин). • Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой. Грамположительные Грамотрицательные Фиксация Крист. фиолетовый Раствор йода Обесцвечивание Фуксин

Окрашенные бактериальные клетки

Антигены грамотрицательных бактерий Оантиген Наружнее ядро Липополисахариды Внутренее ядро Наружняя мембрана Липид А Липопротеины Периплазматическое пространство Пептидогликан МФО Ундекапренилфосфат с сахарами Внутренняя мембрана Фосфолипиды

Структура Kdo 2 -липида А