КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Лекция 2 – Принципы культивирования

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Лекция 2 – Принципы культивирования животных клеток

ПЛАН ЛЕКЦИИ 1. История культивирования клеток высших животных 2. Происхождение и характеристика клеток 3. Дифференцировка 4. Органная культура клеток

История культивирования клеток высших животных 1 -ый этап - первое десятилетие XX века - признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro

История культивирования клеток высших животных 2 -ой этап работ - после того, как была продемонстрирована возможность выращивания и репродукции в таких клектках фильтрующихся инфекционных агентов - вирусов

История культивирования клеток высших животных Третий этап истории начинается со времени, когда была показана практическая возможность получения в клетках животных больших количеств вирусного материала для применения в вакцинных препаратах

История культивирования клеток высших животных В этот период: 1)стало возможным вставить в клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию и 2)2) подтверждена возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой популяции.

История культивирования клеток высших животных Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре, потребовалось овладеть рядом подходов и методик: 1. Методики получения клеток, свободных от экзогенных прокариотов и грибов. 2. Методики разработки среды, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется. 3. Методики наблюдения за клетками в динамике их развития. 4. Методики непрерывного культивирования культур клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.

История культивирования клеток высших животных Клод Бернар - предположил, что: • Не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий, но и клетка вне организма животного тоже будет стремиться поддерживать свои внутренние условия • Если различия между внутренними и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста и деления клетки. • Возникла необходимость разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне организма

История культивирования клеток высших животных 1885 - У. Ру (W. Roux) показал возможность сохранения вне организма живых тканей на практике. Он сохранял в жизнеспособном состоянии оболочку куриного эмбриона в теплом физиологическом растворе.

История культивирования клеток высших животных 1897 - Лёб (Loeb) поддерживал в жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в пробирках с сывороткой и плазмой крови.

История культивирования клеток высших животных 1898 - Льюнгрен показал возможность поддержания эксплантатов кожи человека в жизнеспособном состоянии в кислой среде с сохранением способности к реимплантации.

История культивирования клеток высших животных 1903 - эксперименты Джолли, наблюдавшим деление клетки в висячей капле, содержащей лейкоциты саламандры 1906 - Биб и Эвинг подтвердили это при пересадке лимфосаркомной ткани собаки.

История культивирования клеток высших животных 1907 - Росс Харрисон с помощью «камеры» из лимфатического тромба лягушки с внедренными в него небольших кусочков ткани, отторгнутых от медуллярного сосуда, наблюдал рост нервных клеток в течение нескольких недель.

История культивирования клеток высших животных 1910 - Барроуз для других клеток тканей теплокровных животных вместо лимфатического тромба использовал тромб плазмы курицы.

История культивирования клеток высших животных 1913 - Алексис Каррель применил плазму крови, обогащенную экстрактом эмбриона. Добавка такого экстракта ускоряла рост тканей.

История культивирования клеток высших животных 17 января 1912 г. - начата инкубация клеток сердца куриного эмбриона, пересев клеток продолжил Эблинг, как он сам заявлял, работая с ними 34 года.

История культивирования клеток высших животных Тироде модифицировал раствор Рингера и в дополнение к куриной сыворотке и эмбриональному экстракту стал использовать коагулят фибрина. 1928 - для наблюдения за делящимися клетками животных Канти разработал метод кинофотомикрографии.

История культивирования клеток высших животных Тогда же предложена методика применение трипсина для высвобождения клеток из тканевой матрицы, в которой они находятся. 1937 - Симмс и Стидлман использовали ее для пассирования клеток между культурами плазмы.

История культивирования клеток высших животных 1948 - впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки получены Эрлом с сотрудниками 1955 - Игл систематически исследовал пищевые потребности клеток. Среды Эрла и Игла используют и сейчас

История культивирования клеток высших животных 1952 - выделены Джеем с сотрудниками из раковой опухоли шейки матки человека клетки He. La. Перевиваемая линия карциномы шейки матки используется и в настоящее время во многих лабораториях мира.

История культивирования клеток высших животных 1961 - Хейфлик и Мурхед выделили линию диплоидных клеток человека (НDС) WI-38. Относительно линии WI-38 было показано, что период ее существования в культуре ограничивается приблизительно 50 удваиваниями популяции.

История культивирования клеток высших животных Последующий этап в истории культивирования диплоидных клеток человека связан с установлением факта, что они являются генетически стабильными и свободными от всех известных латентных и онкогенных вирусов.

История культивирования клеток высших животных В соответствии с целями и задачами экспериментальной работы можно выделить два направления культивирования животных клеток: - культуры клеток; - культуры органов и тканей (органные культуры).

История культивирования клеток высших животных Уже введены в культуру: . • элементы соединительной ткани человека (фибробласты), • скелетные ткани (кость и хрящи), • скелетные, сердечные и гладкие мышцы, • эпителиальные ткани (печень, легкие, почки) • клетки нервной системы • эндокринные клетки (надпочечники, гипофиз • клетки островков Лангерганса) • меланоциты и различные опухолевые клетки.

История культивирования клеток высших животных • Нормальные ткани дают начало культурам с ограниченным временем жизни, тогда как культуры, полученные из опухолей, способны пролиферировать неограниченно долгое время. • Дифференцировка нормальных клеток в культуре сопровождается обычно полным прекращением пролиферации клеток. • В культурах опухолевых клеток возможна частичная дифференцировка при сохранении способности к пролиферации.

Происхождение и характеристики клеток • Культуры клеток лишены структурной организации, теряют характерную гистиотипическую архитектуру и биохимические признаки • У культивируемых клеток трудно контролировать динамические свойства и реконструировать in vitro некоторые клеточные взаимодействия, наблюдаемые in vivo.

Происхождение и характеристики клеток • В связи с этим некоторые исследователи предпочитают использовать клеточные системы, сохраняющие структурную целостность исходной ткани

Происхождение и характеристики клеток • Культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с соответствующими зрелыми тканями. • Причина этого - низкий уровень специализации и наличие реплицирующихся клеток- предшественников в эмбрионах.

Происхождение и характеристики клеток • В качестве примеров широко используемых линий эмбриональных клеток можно привести различные линии ЗТЗ (мышиные эмбриональные фибробласты), линию MRC-5 и другие линии эмбриональных легочных фибробластов человека. • Клетки мезодермального происхождения (фибробласты, клетки эндотелия, миобласты) легче культивировать, чем эпителиальные клетки, нейроны и клетки эндокринных тканей.

Происхождение и характеристики клеток • Пролиферативная способность взрослых тканей ниже, они содержат больше неделящихся специализированных клеток. • Получение первичных культур клеток взрослых тканей и их размножение является более сложной задачей, продолжительность жизни таких культур, как правило, невелика.

Происхождение и характеристики клеток • Клетки одного и того же типа в ткани взаимодействуют друг с другом и согласовывают скорость деления, чтобы поддерживать надлежащую плотность популяции. • «Социальный» контроль такого рода четко проявляется при реакциях на повреждение.

Происхождение и характеристики клеток • Сходное явление можно наблюдать на диссоциированных клетках в культуре. • Эпителиальные клетки или фибробласты, помещенные в чашку, в присутствии сыворотки будут «приклеиваться» к поверхности, распластываться и делиться до тех пор, пока не образуется сплошной монослой, в котором соседние клетки соприкасаются.

Происхождение и характеристики клеток • Свежевыделенные культуры носят название первичных культур до начала пассирования или субкультивирования. • Клетки первичной культуры гетерогенны и характеризуются низкой пролиферацией. В них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены. • Пассирование обеспечивает возможность продления существования культуры, возможность клонирования, исследования и сохранения свойств клеток.

Происхождение и характеристики клеток • При пассировании получаются более однородные популяции, а также теряются специализированные клетки. • После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. • Свойством "бессмертности" обладают в основном клетки, полученные из опухолей.

Происхождение и характеристики клеток • Признаки появления постоянной линии клеток: • морфологические изменения (уменьшение размера клеток, снижение их адгезивности, округление, увеличение ядерно/цитоплазматического отношения) • увеличение скорости роста (время удвоения клеток в культуре снижается с 36 - 48 до 12 - 36 часов)

Происхождение и характеристики клеток • Признаки появления постоянной линии клеток: • снижение зависимости от сыворотки • увеличение эффективности клонирования • снижение зависимости от субстрата • увеличение гетероплоидности (хромосомные различия между клетками) и анеуплоидности • увеличение опухолеродности. • Нормальные клетки могут трансформироваться в постоянную линию, не становясь при этом злокачественными.

Происхождение и характеристики клеток • Эпителиальные клетки или фибробласты, помещенные в чашку, в присутствии сыворотки будут «приклеиваться» к поверхности, распластываться и делиться до тех пор, пока не образуется сплошной монослой , в котором соседние клетки соприкасаются. • Адгезивные контакты обеспечиваются образованием комплексов из поверхностных рецепторов мембраны клетки.

Происхождение и характеристики клеток • В результате поперечного движения гликопротеидов в мембране образуются электронноплотные бляшки гликопро теиновых комплексов. • Бляшки формируются в ответ на воздействие антител, агглютинирующих агентов (лектины) или соседних клеток. • При адгезии субстрат действует как многовалентное антитело, а образующиеся бляшки называют « адгезивными пятнами» . Эти пятна богаты «адгезивными белками» и всегда выделяют элементы цитоскелета , которые удерживают гликопротеиды.

Происхождение и характеристики клеток • Образовавшиеся на клетке адгезивные пятна формируют выступы, с помощью которых и происходит перемещение. • Выступы цитоплазмы (ложноножки, псевдоподии) при контакте с соседней мембраной ингибируют движение. • Клетки в этом случае направляют свои псевдоподии в другом направлении (феномен контактного ингибирования). • Когда культура станет монослойной , активность ложноножек и движение клеток прекращается.

Происхождение и характеристики клеток • Нормальные клетки перестают делиться, это явление, известно как торможение пролиферации, зависимое от плотности. • Если такой монослой «поранить» иглой таким образом, чтобы на чашке образовалась свободная от клеток полоска, клетки с краев этой полоски начинают продвигаться на свободное место и делиться. • Вначале такие явления объясняли только контактным торможением клеточного деления, но это, видимо, не отражает сути дела.

Происхождение и характеристики клеток • Плотность клеточной популяции, при которой клетки в сплошном монослое перестают делиться, увеличивается с повышением концентрации факторов роста в среде. • Кроме того, оказалось, что если культуральная жидкость будет протекать по поверхности чашки с островками клеток, то клетки, омываемые средой, только что прошедшей над другими клетками, будут делиться медленнее , чем те, которые омываются средой, прошедшей над свободными от клеток участками. В среде,

Происхождение и характеристики клеток • Фактор роста обычно присутствует в среде в концентрации около 10 -10 М (примерно одна молекула в объеме сферы диаметром 3 мкм). • Один фибробласт имеет около 10 5 рецепторов фактора роста, каждый из которых обладает очень высоким сродством к нему. • Таким образом, у каждой клетки достаточно рецепторов, чтобы связать все молекулы ростовых факторов в объеме сферы диаметром около 150 мкм.

Происхождение и характеристики клеток • Факторы, влияющие на скорость деления в клеточной культуре: • Конкуренция за факторы роста и питательные вещества • Форма клеток во время их распластывания и движения по поверхности субстрата на свободные места • При культивировании нормальных клеток в суспензии, когда они не прикреплены к твердой поверхности и поэтому имеют округлую форму, они почти никогда не делятся (зависимость деления от прикрепления).

Происхождение и характеристики клеток • Частота деления клеток возрастает с увеличением степени их распластывания. • Возможно, что сильно распластанные клетки могут улавливать больше молекул фактора роста и поглощать больше питательных веществ благодаря своей большей поверхности. • Некоторые типы клеток, почти не способные к пролиферации в суспензии, охотно делятся, как только им удается вступить в контакт с участком субстрата, даже если этот участок настолько мал, что клетка не может на нем распластаться.

Происхождение и характеристики клеток • Контроль клеточного деления каким-то образом связан с организацией цитоскелета. • Механизм и функции этой связи не ясны, можно думать, что зависимость деления клеток от их прикрепления, вероятно, позволяет ткани сохранять целостность и предотвращает пролиферацию клеток, обособившихся от нормального окружения. • Цикл прикрепления и открепления, вероятно, позволяет перегруппировать адгезивные контакты как между клетками, так и между клетками и матриксом, чтобы встроить вновь возникшие дочерние клетки в ткань, перед

Происхождение и характеристики клеток • Ослабление контактов, видимо, составляет важную особенность пролиферативного поведения большинства типов клеток. • Например, в ранней стадии реакции фибробластов на ростовой фактор отмечается разрушение их фокальных контактов. • Потеря управляемости роста у раковых клеток почти всегда связана с необратимым уменьшением клеточной адгезивности , которое проявляется также в потере фокальных контактов при выращивании таких клеток в культуре.

Происхождение и характеристики клеток • Изменение ростовых свойств культивируемых клеток называется трансформацией. • Она необратима и, очевидно, включает генетические изменения в части наследственной информации, контролирующей неопластический фенотип, добавляемый к трансформированному геному хозяина. • Изменение ростовых свойств является одной из адаптивных особенностей, позволяющей клеткам пролиферировать в условиях, неблагоприятных для нетрансформированных клеток

Происхождение и характеристики клеток • Трансформированные клетки способны расти в условиях, в которых геометрические характеристики, а именно отношение площади поверхности к объему менее благоприятны. • Следовательно, трансформированные клетки будут расти в суспензионных культурах, образуя сферические клоны . Так, трансформированные клетки, будучи введенными иммунологически толерантным животным в относительно небольших количествах, могут образовывать опухоли. • По этой причине трансформация иногда

Происхождение и характеристики клеток • Трансформация может быть или вирусной, или «спонтанной» . • Когда при исследованиях использовали хорошо известные трансформирующие вирусы, такие, как вирусы SV 40 и полиомы, то свойства трансформированных клеток проявлялись очень наглядно и были описаны подробно. • Аналогичные изменения, наблюдавшиеся после спонтанной трансформации, привели к предположению, что такая трансформация является результатом активации последовательностей генов (онкогенов) , уже

Происхождение и характеристики клеток • Многие исследования подтвердили, что спонтанно трансформированные клетки имеют такую же последовательность оснований в ДНК, как и в клетках, трансформированных вирусами. • Но в одной из работ было показано, что аналогичные (может быть, неразличимые) изменения вызываются также точечными мутациями в нормальных генах.

Происхождение и характеристики клеток • Старение характерно для клеток, имеющих ограниченный потенциал пролиферации, то есть низкую плотность насыщения при идеальных условиях культивирования. • Примером могут служить линии диплоидных клеток человека. • Повышенная способность к росту трансформированных клеток означает, что трансформация преобладает над процессом старения.

Происхождение и характеристики клеток • Старение, безусловно, зависит от генетических факторов, так каждый вид имеет характерную продолжительность жизни, но вариабельность внутри популяций по этому показателю свидетельствует также о влиянии фенотипа. При адаптировании диплоидных клеток человека (линия WI 38) уже с самого начала было показано, что культивируемые клетки могут проявлять феномен старения и имеют ограниченное время жизни (50± 10 удваиваний популяции).

Происхождение и характеристики клеток • Зависящие от возраста изменения, которые при этом наблюдались, включали удлинение межмитотических интервалов (19± 25% — 31 ± 41%/час), изменение метаболизма, уровней ферментов и экспрессии продукта. Следует отметить, что не установлено четкой связи между продолжительностью жизни в зависимости от происхождения клетки (мышь, человек) и потенциалом удваивания их клеток в культуре.

Происхождение и характеристики клеток • Ограниченные по продолжительности жизни клеточные линии, например линии диплоидных клеток фибробластов, не являются идеальными объектами для целей производства, поскольку их должны использовать до того, как в клетках произойдут серьезные изменения старения. • В практических отношениях это означает, что период жизни этих клеток, когда их можно применять в целях производства, заключается между 12 и 30 пассажами (в первом случае — для приготовления посевного материала).

Происхождение и характеристики клеток • Трансформированные же клетки не имеют ограниченной продолжительности жизни, и это обусловливает такое их преимущество в биотехнологии, как использование в качестве субстрата для генерации различных продуктов в сочетании с более высокими плотностями популяции клеток, более высокими скоростями роста и способностью расти в суспензиях.

Дифференцировка • Дифференцировка нормальных клеток в культуре сопровождается полным прекращением пролиферации клеток. • В культурах опухолевых клеток возможна частичная дифференцировка при сохранении способности к пролиферации. • Ведение клеточных линий требует постоянного увеличения количества клеток • выбор условий культивировании направлен на обеспечение максимальной скорости клеточной пролиферации.

Дифференцировка Эти условия неблагоприятны для дифференцировки клеток, при которой их рост существенно ограничивается или полностью подавляется. Условиям, способствующие размножению клеток: • низкая плотность • невысокая концентрация Ca 2+ • присутствие ростовых факторов, таких как фактор роста эпидермиса, фактор роста фибробластов и фактор роста, синтезируемый тромбоцитами.

Дифференцировка • Способствуют прекращению клеточного деления и индуцируют дифференциpoвку клеток: • Высокая плотность клеток (выше 10 5 клеток на 1 см 2) • Высокая концентрация Ca 2+ (300— 1500 мкмоль); • присутствие индукторов дифференцировки (гормоны, например гидрокортизон, фактор созревания глии, фактор роста нервов, ретиноиды и полярные растворители, в частности диметилсульфоксид) • Низкие концентрации сыворотки способствуют дифференцировке олигодендроцитов , но для дифференцировки бронхиального эпителия в ороговевающий используют высокие концентрации сыворотки.

Дифференцировка • Большое значение, особенно для эпителия, имеет установление правильной полярности клеток и их формы. Клетки, растущие на взвеси коллагенового геля, смываются питательной средой со всех сторон, и это позволяет устанавливать правильную полярность относительно базальной мембраны, а также поддерживать правильную форму клеток благодаря субстрату.

Органная культура клеток • Исходно тканевыми культурами называли эксплантаты целых фрагментов тканей, полагая, что в этих фрагментах, по крайней мере частично, поддерживается гистологическая целостность. • В настоящее время «культура ткани» превратилась в общее понятие, включающее в себя как органную культуру, в которой небольшие фрагменты ткани или целые эмбриональные органы эксплантируются с сохранением тканевой архитектоники, так и культуру клеток, в которой ткани диспергируются механически, ферментативно или путем спонтанной миграции клеток из эксплантации, и клетки размножаются в виде суспензии или монослоя, прикрепившегося к субстрату клеток.

Органная культура клеток • При выборе того или иного типа культуры следует принимать во внимание следующее. • Органная культура сохраняет межклеточные взаимодействия, в течение долгого периода времени поддерживает гистологическую и биохимическую дифференцировку и после начальной травмы эксплантации и ряда центральных некрозов остается, как правило, в нерастущем равновесном состоянии в течение нескольких дней и даже недель. • Культуры клеток, наоборот, как правило, лишены структурной организации, теряют характерную гистиотипическую архитектонику и связанные с ней биохимические признаки и обычно не достигают равновесного состояния, в отсутствие определенных условий.

Органная культура клеток • Клетки в культурах размножаются, что обеспечивает получение большой массы клеток и их разделение на идентичные параллели. • Культивируемые клетки могут, быть охарактеризованы, и определенная клеточная популяция может быть сохранена путем замораживания. • Клетки идентифицируют по фенотипическим признакам, путем выращивания в селективной среде, физического отбора, клонирования или генотипически для получения относительно однородной линии клеток.