Клетки предлагаемые для терапии Дифференцированные клетки взрослых тканей

Клетки, предлагаемые для терапии Дифференцированные клетки взрослых тканей (фибробласты кожи, гепатоциты, клетки мононуклеарной фракции крови) Стволовые клетки n Эмбриональные w Клетки внутренней массы бластоцисты (ЭКО) w Тканеспецифичные прогениторные клетки плода (аборты после 20 недели) n Соматические (аутологичные и аллогенные) w w w циркулирующие в крови; из костного мозга (мезенхимальные и гемопоэтические); стромальные из жировой ткани; миобласты скелетных мышц; другие региональные предшественники (ольфакторный эпителий) Индуцированные плюрипотентные клетки

Клетки, предлагаемые для терапии Эмбриональные Соматические Аллогенные Аутологичные Доступность нет да да Дифференцировка in да Да, с ограничениями Дифференцировка in да, тератомы ? ? Секреторная активность да да да Перенос инфекций да да нет Иммунологическая совместимость нет да vitro vivo

Индуцированные плюрипотентные клетки Эмбриональные Аутологичные соматические Аутологичные ИП-клетки Доступность нет да да Дифференцировка да с ограничениями да Вероятность трансформации после трансплантации да, тератомы ? да, тератомы Секреторная активность да да - Перенос инфекций да нет Иммунологическая совместимость нет да да in vivo

Для восстановления необходима мобилизация клеток-предшественников Мобилизация Адгезия Миграция по градиенту хемоаттрактанта Костный мозг Дифференцировка

Мобилизация Активация резидентных стволовых клеток: открепление от ниши, пролиферация, дифференцировка, выход из депо (направленная миграция) Происходит под действием цитокинов, гормонов, гипоксии, физической нагрузки, терапии лекарственными препаратами (статинами, ингибиторами АТ 1), воспаления, травмы

Клетки-предшественники располагаются в «нишах» Ниша - физиологически ограниченное микроокружение, в котором располагаются стволовые клетки (Schofield, 1978) Состоит из поддерживающих клеток (в костном мозге - остеобласты или эндотелий) Поддерживает баланс между самообновлением и дифференцировкой Защищает от неблагоприятных воздействий

Примеры ниш Стволовая клетка Расположение Клетки «ниши» Гемопоэтическая СК Эндостель; рядом с кровеносными сосудами (в их стенке) Остеобласты, остеокласты, мезенхимальные клетки, эндотелий СК скелетных мышц Под базальной пластинкой на мышечном волокне Мышечные волокна? Нейральные СК Субвентрикулярная зона Эндотелий СК кишечного эпителия Дно крипты Фибробласты? Клетки Панета? СК эпидермиса Волосяная сумка Клетки сосудистой стенки? адапт. из Morrison and Spradling. Cell 132, 598– 611, February 22, 2008

Схема ниши для HSCs в костном мозге

Схема ниши для СК в скелетной мышце

Схема выхода СК из ниши CXCR 4 SDF-1 alpha деление клеток расщепление «скрепок»

Открепление СК от ниши

Мобилизация СК при повреждении скелетной мышцы

При мобилизации ГСК переходят из остеобластоидной ниши в васкулярную Yin T. & Li L. J. Clin. Invest. 2006, 116: 1195 -0

Мобилизация под действием G-CSF норма стимуляция

Мобилизация гематопоэтических СК под действием G-CSF Подавление SDF-1 на остеобластах и его повышение в крови: открепление от ниши Индукция протеолитических ферментов (эластазы, катепсина G, ММР-2 и ММР-9): трансэндотелиальная миграция, расщепление

Эффективность Индукция воспаления Факторы, мобилизующие ГСК из костного мозга Костный мозг GM-CSF G-CSF HMGB 1 VEGF SDF-1 эритропоэтин ангиопоэтин-1 Статины Нагрузка эстроген

Источники факторов, мобилизующих ГСК из костного мозга

Повреждение вызывает выброс микровезикул, влияющих на СК

Модель выбора дифференцировки СК в зависимости от фазы клеточного цикла Фенотип СК может меняться в зависимости от фазы клеточного цикла и микроокружения до получения стимула к терминальной дифференцировке (Quesenberry et al. , 2007)

Хоминг и интерстициальная миграция Хоминг – процесс распределения клеток по тканям организма с током крови до распознавания и взаимодействия с микрососудистым эндотелием в участкемишени Интерстициальная миграция – активное амебоидное движение клеток под действием экстраваскулярных направляющих факторов, не зависит от тока крови

Хемоаттрактанты для СК

Адгезия и инвазия изменение конформации и поляризация 1 и 2 интегринов PSGL-1 Е-селектин катепсин L Р-селектин VEGF SDF-1 HMGB 1 некроз воспаление ишемия

Адгезия СК

Адгезия к компонентам матрикса Фибрин (васкуляризация тромбов) Коллаген I и IV Фибронектин Ламинин

Вероятные механизмы действия клеточных препаратов • Дифференцировка (трансдифференцировка), замещение утраченных клеток • Секреция факторов роста • стимуляция трофики • подавление апоптоза • активация резидентных стволовых клеток • продукция микровезикул

СК продуцируют микровезикулы, стимулирующие репарацию

Мобилизация vs. трансплантация Трансплантация Мобилизация Инвазивность Да, для аутологичных Нет Использование специфичного типа клеток Да Нет Необходимость выделения клеток из тканей Да Нет Наращивание клеток в культуре: Да Нет Выживание после введения в ткань ? N/A -Возможность многократного умножения -Риск передачи инфекций -Риск накопления геномных аберраций

Получение клеточных препаратов Выделение клеток из ткани Экспланты (только культивирование) Ферментативная обработка Центрифугирование Очистка (обогащение) Иммуносортинг Селективная адгезия Селективные среды культивирования Культивирование

Выделение клеток из жировой ткани Жировая ткань Ферментативная обработка Разделение на фракции Лизис эритроцитов в осадке Осадочная фракция: клетки стромы, сосудов, лейкоциты, эритроциты Фильтрация Осаждение Культивирование через 5 дней после выделения

Препараты аутологичных стромальных клеток жировой ткани Лечение пародонтита (пародонтоза) Стимуляция ангиогенеза в ишемизированных тканях Восстановление периферических нервов при травмах и ЦНС при нейродегенеративных заболеваниях Лечение стрессового недержания мочи и обратного заброса мочи у женщин Лечение свищей и фистул в проктологии Восстановление костных дефектов Введение в кожу при истонченном фенотипе и недостаточном слое подкожной жировой клетчатки

Выделение фибробластов дермы из биоптатов кожи биоптат 3 х3 мм Ферментативная обработка Осаждение Культивирование Через 2 недели культивирования Маркерный антиген фибробластов CD 90 (красная флуоресценция). Эластин (зеленая флуоресценция). Ядра окрашены DAPI (синяя флуоресценция)

Препараты аутологичных фибробластов кожи Заживление ран Лечение ожогов Лечение трофических язв Лечение возрастных изменений кожи, атрофических рубцов

Выделение клеток-предшественников из костного мозга аспират Суспендирование Лизис эритроцитов Культивирование Дифференцировка в микромассе в хондроциты

Выделение клеток из крови Кровь мононуклеарная фракция Культивирование

Выделение клеток-предшественников из аневризмы сердца Ферментативная обработка Иммуномагнитная селекция c-kit+ клеток Осаждение - с-kit+ клетки-предшественники Маркеры клеток-предшественников Предшественники эндотелия (CD 105) Малодифференцированные клетки (c-kit+) Культивирование

Ближайшие перспективы применения СК в медицине На пленках и носителях для лечения язв, восстановления костной ткани Раневые повязки протезов сосудов Восстановление кровоснабжения ишемизированных тканей

Иммуноселекция: сортировка в потоке сигнал на ФЭУ лазеры + -

Иммуномагнитная селекция Мечение антителами, конъюгированными с магнитными микрочастицами Помеченные клетки остаются на магните в электромагнитном поле, удаляются негативные клетки Помеченные клетки можно смыть с колонки после снятия электромагнитного поля

Паспорт клеточного препарата Тип клеток Происхождение образца Маркировка образца Результаты исследований на инфекционные агенты и аутоиммунные заболевания до взятия биопсии: Антиядерные антитела Антитела к нативной ДНК Антитела к фосфолипидам Ig. M Антитела к фосфолипидам Ig. G Сифилис EIA (ИФА) Ig G/Ig. M (антитела к антигенам Treponema pallidum Ig. G /Ig. M, anti. Treponema pallidum Ig. G /Ig. M, Syphilis TPEIA) Цитомегаловирус, определение ДНК (Cytomegalovirus, CMV DNA) Вирус гепатита В – Hbs. Ag ( «австралийский» антиген). Вирус гепатита В, определение ДНК (качественное) (HBV-DNA). Вирус гепатита С – anti HCV total Микоплазма (Mycoplasma pneumonia), определение ДНК Характеристики образца: Номер пассажа Жизнеспособность клеток % на момент выдачи образца Цвет, консистенция образца р. Н Стерильность К-во флаконов данного образца Объем в каждом флаконе Концентрация клеток число/мл Условия хранения Дата и время выдачи образца Результаты исследований на инфекционные агенты в клеточном образце при выдаче Цитомегаловирус, определение ДНК (Cytomegalovirus, CMV DNA) Микоплазма (Mycoplasma pneumonia), определение ДНК Анализ на стерильность

Ограничения в применении препаратов клеток Иммунологическая совместимость Нежелательный рост (трансформация) Время жизни трансплантированных клеток в ткани-мишени Перенос инфекций Сохранение свойств после длительного культивирования