Классификация мутаций по способу индукции Мутации Спонтанные

Классификация мутаций по способу индукции

Мутации Спонтанные Индуцированные

Причиной возникновения индуцированных мутаций являются мутагены

Ф И З И Ч Е С К И Е Мутагены Х И М И Ч Е С К И Е

Химические мутагены 1. Алкилирующие агенты вызывают алкилирование ДНК (например, метилирование, этилирование и т. д. ). К их числу относятся диметилсульфат, диэтилсульфат, иприт и его производные. Могут приводить к потере или замене оснований

А Ц Пуриновое Г Т

2. Аналоги азотистых оснований (5 -бромурацил, 2 -аминопурин и др. ) А Г

Т Ц

3. Акридиновые красители Акридин оранжевый Профлавин

Азотистые основания Вставка

4. Прочие химические вещества Бензопирендиолепоксид Инактивация белкасупрессора р53, который сдерживает пролиферацию клеток

Делая «затяжку» , помни: частота 5 -летней выживае-мости больных раком легких составляет около 3. 5%

Общие выводы 1. Химические мутагены вызывают в основном мутации на уровне гена (замена, выпадение или вставка оснований). 2. Частота мутаций при действии химических мутагенов как правило выше, чем при воздействии физических мутагенов

Физические мутагены – ионизирующее излучение (альфа–, бета–, гамма–, нейтронное и рентгеновское излучение), – ультрафиолетовое излучение, – радиоволны – cотовые телефоны, Wi-Fi, радиотелефоны

Ионизирующее излучение 1. Непосредственное воздействие частиц с высокой энергией на ДНК приводит к ее разрывам:

2. Опосредованное воздействие ионизирующих факторов связано с нарушением структуры ферментов, участвующих в основных физиологических процессах клетки

Зависимость «доза-эффект»

y = k+αd y – частота мутаций k - частота спонтанных мутаций α – вероятность возникновения мутаций у данного объекта в результате облучения дозой 1 Р d - доза в рентгенах

Факторы, влияющие на мутагенный эффект ионизирующих излучений: 1. Повышенные температуры 2. Кислородная среда

Мутагенное действие ультрафиолета Образование пиримидиновых димеров

Мутагенное действие радиоволн – проблема электромагнитного смога

Основные источники радиоволн Сотовые телефоны 800 -2000 МГц Wi-Fi – 2400 -5900 МГц Wi-Max – 1500 -11000 МГц Dect – телефоны - 1880– 5800 МГц Bluetooth – 2400 -2500 МГц Baby monitors – около 2400 МГц

Сотовые телефоны • 1995 год - 90. 7 млн пользователей в мире • 2010 г ~ 1. 6 млрд пользователей • 2010 г – 216 млн абонентов (население РФ в 2010 г – 142 млн чел) • Август 2011 г - 225, 1 млн (население РФ в 2011 г – 141, 8 млн чел)

Основные эффекты от сотового телефона Часть I: «Голова»

«Мозги закипели…»

Эффект зависит от возраста

Основные типы опухолей головного мозга, развивающиеся вследствие воздействия сотового телефона Риск развития астроцитомы на выше на 170 % - у тех, кто начал пользоваться после 20 лет, на 390 % - до 20 лет

Развитие акустической нейромы (вестибулярной шванномы) Риск повышается до 490 %

Психофункциональные нарушения у молодежи Нарушение сна, депрессия, снижение стрессоустойчивости, развитие синдрома дефицита внимания у школьников

Основные эффекты от сотового телефона Часть II: «Туловище»

Нарушение сердечного ритма, повышение риска внезапной остановки сердца

Часть III: «Ниже пояса»

Снижение количества сперматозоидов в сперме, изменение их морфологии и подвижности

Излучение телефонов вызывает фрагментацию ДНК в сперматозоидах

Andrologia. 2011 Oct; 43(5): 312 -6. Impact of cell phone use on men's semen parameters. Gutschi T, Mohamad Al-Ali B, Shamloul R, Pummer K, Trummer H. Source Medical University of Graz, Austria. Our results showed that cell phone use negatively affects sperm quality in men

орнитиндекарбоксилаза

Рекомендации ВОЗ - запретить использование сотовых телефонов детьми до 16 лет - беременными - лицами с хроническими заболеваниями

DECT-телефоны

2400 -5900 МГц

International Journal of Forestry Research Volume 2010 (2010), Article ID 836278, 7 pages doi: 10. 1155/2010/836278 Больное дерево около Wi-Fi-излучателя

Ministries of Environmental Protection and Health Oppose Expansion of 4 G Mobile Infrastructure http: //www. environment. gov. il/bin/en. jsp? en. Page=e_Blank. Page&en. Disp lay=view&en. Disp. What=Object&en. Disp. Who=News^l 5544&en. Zone=e_ news

Проблема «грязного» электричества

Частота: 1 -500 к. Гц

Новый источник излучений – килогерцовый диапазон

Энергосберегающие лампы • Мерцание 25000 -30000 раз в секунду • Провокация эпилептической активности головного мозга

ГН 2. 1. 6. 1338 -03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест" Одна случайно разбитая лампочка дает в комнате 30 кв. м. от 140 до 240 ПДК по ртути

Защити себя сам

TED 2010 Conference "Фонд Билла и Мелинды Гейтс" • «В мире сегодня 6, 8 млрд. человек. Теперь, если мы действительно сделаем большую работу по новым вакцинам, здравоохранению, услугам в области репродуктивного здоровья, мы уменьшим его, возможно, на 10 или 15 процентов»

7. 8 млрд $: разработка новых контрацептивных технологий МЫ – ПОДОПЫТНЫЕ МЫШИ? . . .

Бесплатный сыр – в мышеловке

Мутации, индуцированные мобильными генетическими элементами

Строение Tn 3 в геноме E. coli

Возникновение делеций и дупликаций Дупликация Делеция

Возникновение инверсий Инвертированный участок

Спонтанные мутации

Частота спонтанных мутаций некоторых генов

Основные источники природного радиоактивного фона - радон и продукты его распада ~ 49. 5% - 40 К ~ 15% - радиевый ряд урана ~ 12. 2% - ториевый ряд урана ~ 8% - космогенные радионуклиды ~ 15. 3%

Эксперимент Планеля с Paramecium caudatum K 10 см + соли тория 5 10

Вывод Природный радиоактивный фон необходим для жизни

Кузин Александр Михайлович (1906 -1999)

Методы учета возникновения мутаций

Учет рецессивных мутаций в Х-хромосоме у дрозофилы

B = Bar l = летальная мутация C = супрессор кроссинговера Р F 2 B Метод Cl. B инверсия ( l B ) C l. B / + самка хромосома +/Y Мутаген самец l B * C l. B / * самка +/Y B самец l * C l. B / + l C l. B l B F 1 l B +/* C l. B / Y * * /Y

Вывод из опыта Если мутаген не индуцировал летальную мутацию, то соотношение самок и самцов в F 2 будет 2 : 1 Если мутаген индуцировал летальную мутацию в Ххромосоме самца, то в F 2 самцы будут отсутствовать

Учет мутаций у микроорганизмов

Тест Эймса Salmonella His- ауксотроф Среда без гистидина Спонтанные ревертанты Среда с мутагеном Ревертанты, индуцированные мутагеном

Модификация теста Эймса

Метод реплик Богатая среда Бедная среда+ Арг

Генетический мониторинг Терминология: Генетический мониторинг – динамический контроль за возможными отрицательными генетическими последствиям воздействия факторов окружающей среды в отношении живых организмов

История развития направления 1972 г. – Стокгольмская конференция ООН по охране окружающей среды: создание Global Environment Monitoring System (GEMS) 1975 г. – в СССР – Н. П. Дубинин и Ю. П. Алтухов предлагают использовать термин «генетический мониторинг» , определив его как наблюдение за уровнем мутационного груза в популяциях человека

Задачи генетического мониторинга - Генетико-токсикологическая оценка - Выявление зон повышенного риска - Оценка динамики и временных тенденций генетических процессов - Оценка разных тест-систем - Построение математических моделей для прогноза изменений на уровне популяций

Характеристика тест-систем для генетического мониторинга • Бактериальные – тест Эймса на клетках Salmonella typhimurium – анализ частот ревертантов • Растительные • Животные – беспозвоночные (дрозофила, водяной ослик и др. ) и позвоночные – рыбы, лягушка озерная, культуры клеток человека

Растительные тест-системы • • • Бобы Vicia fabia 2 n=12 Ячмень Hordeum vulgare 2 n=14 Скерда Crepis capillaris 2 n=6 Горох Pisum sativum 2 n=14 Традесканция Tradescantia pallida 2 n=12 Лук Allium cepa 2 n=16

Частота использования тест-систем по результатам поиска в базе данных Pub. Med на 20 февраля 2012 • • • Бобы Vicia fabia 21, 98 % Ячмень Hordeum vulgare 6, 81 % Скерда Crepis capillaris 2, 48 % Горох Pisum sativum 1, 55 % Традесканция Tradescantia pallida 20, 74 % Лук Allium cepa 46, 44 %

Основные группы веществ, тестируемые в аллиум-тесте • • Металлы Пестициды Ароматические углеводороды Промышленные (текстильные и другие) красители • Дезинфектанты • Прочие вещества

Основные виды генетических нарушений, наблюдаемых в аллиум-тесте • • Нарушения митотического индекса Хромосомные аберрации Изменения морфологии ядер Образование микроядер

Корреляция с другими тестами По данным исследователей (J. Rank, M. H. Nielsen, Mutat. Res. 312 (1994) 17– 24) корреляция между аллиум-тестом и хромосомным тестом у грызунов составляет 82%.

Выводы • Генетический мониторинг занимает важное место в оценке состояния окружающей среды • Растительные биотесты вполне адекватно отражают генетические риски и данные тестов могут быть экстраполированы на организмы более высокой организации

Модификационная (ненаследственная) изменчивость

Терминология Модификации – фенотипические различия у генетически идентичных организмов, вызываемые факторами окружающей среды

Водяной лютик Стрелолист

Модификации носят адаптивный характер Индуцированные человеком модификации называются морфозами

Морфозы, индуцированные обработкой почвы культурой Bacillus oligonitrophilus

Фасциации цветонесущего побега у Calendula officinalis

Фасциации корзинки у Calendula officinalis

Фасциация плода у земляники Fragaria magna

Норма реакции – способность организма реагировать на условия окружающей среды, предопределенная его генетическими задатками

Сравнение модификаций и мутаций

Мутации Модификации Ненаправленность Направленность (? ) (адаптивность) Константность Обратимость Наследуемость Не наследуются (? )

Detection of Mutations in Bacteria DIRECT SELECTION OR ENRICHMENT (for Selective Mutants) 1. Plate the bacteria on a medium on which a mutant but not the parent will grow. 2. Antibiotic or virus senstive parents are killed or do not grow. Dru resistant or virus resistant mutants will grow. 3. Pick and purify colony. Confirm resistance.

Direct Selection of Antibiotic Resistance Mutant

Direct Selection of mutants able to use a specific carbon source

Isolation of a motility mutant by direct selection

Isolation of an auxotrophic revertant by direct selection

Detection of Mutations in Bacteria PENICILLIN SELECTION OR ENRICHMENT (for Nutritional or Auxotrophic Mutants mutants that require a growth factor not needed by the parent) 1. Add penicillin to culture growing in a medium without the growth factor: a. growing bacteria (can make their own growth factor) are killed in the presence of penicillin b. nongrowing bacteria (because they require the missing growth factor) are not killed (Note: penicillin kills ONLY growing cells) 2. Remove Penicillin, add growth factor and auxotrophs (GF-) will grow. This step selects or enriches for the growth of the survivors. 3. Select a survivor colony, and pick, purify and confirm growth factor requirement (auxotrophy).

Detection of Mutations in Bacteria REPLICATE PLATING (Also for Nutritional or Auxotrophic Mutants) 1. Transfer part of every colony growing on a complete medium (contains growth factor) to a minimal medium (lacks the growth factor). 2. Identify colonies growing on the complete medium which do not grow on the minimal medium. These are auxotrophic colonies - they grow with, but not without, the added growth factor. 3. Pick and purify auxotrophic colonies from the complete medium and confirm auxotrophy.

Ionizing radiation

Utlraviolet radiation

Учет рецессивных мутаций в аутосоме у дрозофилы

Ultraviolet radiation pyrimidine dimers

Chemical mutagens benzene diesel exhaust pesticides cigarette tar asbestos formaldehyde

Causes of mutations • • Incorrect base pairing during replication Ionizing radiation – causes double breaks UV radiation – causes pyrimidine dimers Other chemicals may change nitrogenous bases

Point mutation Reading frame shift from insertion or deletion AUGGCCAUCCAACCCAAAUGA met ala iso glu pro lys AUGCCAUCCAACCCAAAUGA met pro ser asp pro asp - ?

Point mutation substitution AUGGCCAUCCAACCCAAAUGA Met ala iso glu pro lys AUGGACAUCCAACCCAAAUGA met asp iso glu pro lys

Point mutation substitution with no effect AUGGCCAUCCAACCCAAAUGA met ala iso glu pro lys AUGGCAAUCCAACCCAAAUG Met ala iso glu pro lys

Crossing over

The genetic code UUU phenylalanine UCU serine UAU tyrosine UGU cysteine UUC phenylalanine UCC serine UAC tyrosine UGC cysteine UUA leucine UCA serine UAA STOP UGA STOP UUG leucine UCG serine UAG STOP UGG tryptophan CUU leucine CCU proline CAU histidine CGU arginine CUC leucine CCC proline CAC histidine CGC arginine CUA leucine CCA proline CAA glutamine CGA arginine CUG leucine CCG proline CAG glutamine CGG arginine AUU isoleucine ACU threonine AAU asparagine AGU serine AUC isoleucine ACC threonine AAC asparagine AGC serine AUA isoleucine ACA threonine AAA lysine AGA arginine AUG Methionine START ACG threonine AAG lysine AGG arginine GUU valine GCU alanine GAU aspartate GGU glycine GUC valine GCC alanine GAC aspartate GGC glycine GUA valine GCA alanine GAA glutamate GGA glycine GUG valine GCG alanine GAG glutamate GGG glycine

Mutations in the introns may have no deleterious effect.

Mutations with no effect • Mutation of DNA coding for m. RNA before the start sequence (AUG) • Mutation of DNA coding for m. RNA after the stop sequence (UGA, etc) • Mutation of DNA coding for m. RNA in an intron region • Mutation of DNA coding for m. RNA codon in which the third nucleotide of a codon is changed, but still codes for the same amino acid • Mutation of DNA that is never transcribed

CAUSES OF CANCER • inappropriate activation of proteins that regulate the cell cycle (proto-oncogenes) • inactivation of proteins that normally suppress cell division (tumor suppressor genes)

Cancer vocabulary tumor cluster of cells that continuously expands in size metastases cells that leave a tumor to spread in other parts sarcoma tumors in connective tissue, bone or muscle carcinomas tumors in epithelial tissue (skin, lining) carcinogens agents thought to cause cancer benign doing little or no harm malignant very dangerous, deadly

The death rate from cancer increases with age due to the accumulation of mutations

Mutagens • Radiation – Ionizing radiation chemically alters DNA, breaks one or two DNA strands • Leads to replication failure, death – Ultraviolet radiation causes thymine dimers to form • Kink in DNA chain also leads to replication failure unless repaired. http: //www. bio. cmu. edu/Courses/03441/Term. Papers/96 Term. Papers/spontaneous/dimer-2. jpg

• Chemical changes Mutagens-2 change one base to – Many mutagens are chemicals that another, cause mispairing. – Others are base analogs, used instead of real base, cause mispairing or disrupt replication. • Frameshifts – Flat molecules (ethidium bromide, acridine orange) intercalate into DNA (slip between flat bases). • When replication occurs, extra base added, disrupts reading frame, scrambles codons.

Non-mutagen cause of mutations (causes background level) • Copying errors – Fairly rare; enzyme messes up and doesn’t catch mistake – DNA polymerase has a 3’ to 5’ exonuclease activity that backspaces, deletes mistakes. • Bases themselves undergo spontaneous change to wrong base. Repair sometimes doesn’t happen. – Cytosine to uracil change is detected, removed. – Missing purines are detected, repaired.

• The mutationdamaged often DNA rate is variable repaired – Typical 1^106 per generation – Rare, so DNA damage must be frequently repaired. • Repair of thymine dimers – Excision repair: bad spot of DNA cut out, replaced – Light repair: a photon of blue light + enzyme undoes it. • Mismatch repair: if base pairs aren’t a pair – Stretch of newer DNA is cut out, replaced. • SOS repair: too much damage!! – Base pair “fidelity” is relaxed to save time. More mutations produced, but cells live.

Учет мутаций в тесте Эймса Брюс Эймс – His- мутанты of Salmonella – Plated onto medium without histidine, won’t grow • If chemical is a mutagen, revertants will appear at high frequency, no longer need histidine in medium. • Test often done with liver extract; enzymes mimic human body where metabolite may be mutagen.

Using mutations-2 • How to get a mutant like the his- mutant? – Treat with a mutagen (UV light, chemical, etc. ) – Spread survivors onto rich nutrient medium, get colonies. • Many bacterial mutants that are studied have nutritional defects. – Wild type (normal) is called a prototroph – Mutant that can’t make a nutrient is called an auxotroph. • This example: looking for a serine auxotroph.

First, expose cells to mutagen, then spread onto defined medium containing Replica platingother nutrients. many amino acids and Replica plate onto medium with same composition except NO SERINE.

Result of replica plating • Look: where did a colony NOT grow on this plate? • Go back to original plate and grow colony. www. sp. uconn. edu/. . . / lectures/genetics 1. html

Transposon mutagenesis and positive selection of mutants • Transposons – Piece of DNA that can copy itself and insert at random into the bacterial chromosome. – Contains gene for transposase, DNA sequences needed for insertion, and an antibiotic resistance gene. • Transposons are useful for making mutants – Insertion is random, so there is the possibility of mutating the gene you are looking for. – Antibiotic resistance provides a “selectable marker”

Transposon mutagenesis-2 • Use a virus or conjugating donor bacterium to introduce Tn 5 into recipient. • Once DNA with Tn 5 is in cell, transposon jumps once into recipient’s DNA, causing a different mutation in each cell. • Plate recipient cells onto kanamycin-containing agar; only cells with transposon mutations survive. – This is positive selection • Mutations can now be mapped, cloned, or whatever else you wish to do.

Результат курения