Классификация микроорганизмов. Правила работы в микробиологической лаборатории
Систематика и номенклатура бактерий Мир м/о чрезвычайно многообразен. В настоящее время описано более 3, 5 тыс. видов бактерий, но их число постоянно возрастает. Разобраться в этом многообразии можно благодаря систематике. Систематика – наука о классификации организмов, их эволюционном родстве и взаимоотношениях друг с другом. Систематика включает в себя три самостоятельные составные части: классификацию, идентификацию, номенклатуру. Классификация – это распределение множества организмов на основе учета их общих признаков на классы, группы (таксоны). Теория классификации, помогающая распределить все составляющие живой природы в определенном порядке, называется таксономией. Термины «систематика» и «таксономия» часто употребляют как синонимы, однако систематика представляет собой более широкое понятие.
Идентификация – это определение принадлежности изучаемого организма к тому или иному таксону (классу, порядку, семейству, роду, виду и пр. ). Номенклатура – это свод правил присвоения названий таксонам и список этих названий. Номенклатура – это заключительный этап систематики после классификации, выполняет функции «информационного языка» и до некоторой степени независима от классификации.
Карл Линней (1707— 1778) использовал в классификации четыре уровня (ранга): классы, отряды, роды и виды. Введённый Линнеем метод формирования научного названия для каждого из видов используется до сих пор (применявшиеся ранее длинные названия, состоящие из большого количества слов, давали описание видов, но не были строго формализованы). Использование латинского названия из двух слов — название рода, затем видовой эпитет — позволило отделить номенклатуру от таксономии. Данное соглашение о названиях видов получило наименование «бинарная номенклатура» .
Согласно бинарной номенклатуре название рода пишется латинскими буквами с прописной, название вида – со строчной буквы. Видовое название микроорганизма, как правило, представляет собой производное от существительного, дающего описание какоголибо существенного признака этого микроорганизма (цвет образуемой колонии, место обитания, вызываемый патологический процесс).
Основной номенклатурной единицей служит вид. Вид – это совокупность микроорганизмов, имеющих единое происхождение и генотип, сходных по морфологическим и биологическим свойствам, обладающих наследственно закрепленной способностью вызывать в среде естественного обитания качественно определенные специфические процессы.
Различают группы микроорганизмов, выделяемые внутри видов, различия между которыми обусловлены отклонением какого-либо одного наследственного признака. Их называют варианты: морфовары, серовары, резистенсвары и фаговары, патовары, биовары, эковары.
Виды, связанные генетическим родством, объединяют в роды, роды в семейства, семейства в порядки, затем в классы, отделы, царства. • Neisseria в систематике бактерий • Род Neisseria входит в семейство Neisseriaceae, порядок Neisseriales, класс Betaproteobacteria, тип протеобактерии (Proteobacteria), царство Бактерии. В род Neisseria в настоящее время включены виды: N. animalis, N. animaloris, N. bacilliformis, N. canis, N. cinerea, N. dentiae, N. elongata, N. europea, N. flavescens, N. gonorrhoeae, N. iguanae, N. lactamica, N. macacae, N. meningitidis, N. mucosa, N. oralis, N. perflava, N. pharyngis, N. polysaccharea, N. shayeganii, N. sicca, N. subflava, N. wadsworthii, N. weaveri, N. zoodegmatis. Патогенные м/о (бактерии) относятся к царству прокариот (Procaryotae) (от греч. pro – до, karion – ядро) - у них нет оформленного ядра, молекула ДНК располагается в цитоплазме клетки. К прокариотическим микроорганизмам относят сине-зеленые водоросли, бактерии, актиномицеты, риккетсии, спирохеты, хламидии, микоплазмы. (микоплазмы отнесены в отдельный класс Mollicutes, они лишены клеточной оболочки. ) Патогенные простейшие и грибы – царство эукариот (Eucaryotae) – (от греч. Eu- настоящий, истинный, karion – ядро) – молекулы ДНК связаны с белками и РНК, образуют хромосомы внутри ядра, внутри ядра находится ядрышко. Вирусы объединяются в отдельное царство (Vira)
Сегодня задача быстрой идентификации прокариотных организмов наиболее полно решается с помощью издания «Определитель бактерий» , периодически выпускаемого Обществом американских бактериологов с привлечением крупных специалистов в области изучения тех или иных групп бактерий. Первое издание определителя было выпущено в 1923 г. группой американских бактериологов под руководством Д. X. Берги (1860 - 1937 гг. ); девятое издание в 4 томах вышло в 1984 -1989 гг. В девятом издании «Определителя бактерий» Берги все обнаруженные организмы, отнесенные в царство Рrоcаrуоtaе, разделены на 33 группы. Признаки, по которым осуществляется разделение на группы, как правило, относятся к категории легко определяемых и вынесены в названия групп, например: грамотрицательные аэробные палочки и кокки (группа 4), анаэробные грамотрицательные кокки (группа 8), грамположительные палочки и кокки, образующие эндоспоры (группа 13). Основная идея классификации по Берги легкость идентификации бактерий.
Для осуществления этого используют совокупность признаков: 1. Морфологические признаки величина, форма, характер взаиморасположения. 2. Тинкториальные свойства способность окрашиваться различны ми красителями. Особенно важным признаком является отношение к окраске по Граму, которое зависит от структуры и химического состава клеточной стенки бактерий. По этому признаку все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные. Морфологические свойства и отношение к окраске по Граму определяют принадлежность к крупным таксонам роду, семейству и т. д. 3. Культуральные свойства особенности роста на жидких и плотных питательных средах. 4. Подвижность бактерий. Различают подвижные (ползающие или скользящие, плавающие) и неподвижные бактерии. 5. Спорообразование форма и характер расположения споры в клетке. 6. Физиологические свойства способы углеродного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминоавтотрофы, аминогетеротрофы) питания; тип дыха ния: аэробы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы, микроаэрофилы.
7. Биохимические свойства способность ферментировать различные углеводы, протеолитическая активность, образование индола, сероводорода, наличие уреазы и других ферментов и т. д. 8. Чувствительность к специфическим бактериофагам. 9. Антигенные свойства. Они зависят от химического состава клеточной стенки и жгутиков бактерий. 10. Химический состав клеточных стенок (содержание и состав основных сахаров и аминокислот). 11. Липидный и жирнокислотный состав. Изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии, которая обладает высокой разделительной способностью и чувствительностью. 12. Белковые спектры. С помощью методов фракционирования (двумерный электрофорез в полиакриламидном геле) разделяют сложные смеси рибосомных, мембранных или внутриклеточных белков и получают электрофореграммы, или белковые спектры, соответствующей фракции данного вида бактерий. 13. Нуклеотидный состав и последовательность нуклеотидов в моле куле ДНК; наличие и характер минорных оснований в ДНК; нуклеотидный состав рибосомальной РНК; последовательность аминокислот в ферментных белках с аналогичными функциями.
Правила работы в микробиологической лаборатории Лабораторная работа с патогенными микробами проводится в специально оборудованных лабораториях, обеспечивающих режим работы и технику безопасности, исключающих возможность заражения персонала и утечку микробов за пределы лаборатории.
• Необходимость четкой регламентации условий работы с микробами, в различной степени опасными для сотрудников лабораторий и окружающего населения, обусловила разработку классификации микробов, разбив их на 4 группы по степени их биологической опасности (классификация ВОЗ). В России в соответствии с рекомендациями ВОЗ патогенные микробы также делят на 4 группы: 1 -я группа - возбудители особо опасных инфекций; 2 -я группа - возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний человека; 3 -я группа - возбудители инфекционных болезней, выделяемые в самостоятельные нозологические группы; 4 -я группа - условнопатогенные микробы - возбудители оппортунистических инфекций.
Безопасность работ в лабораториях всех категорий обеспечивается выполнением распорядка и правил работы в лаборатории, выполнением требований к лабораторным помещениям и их оснащению, обеспечением лабораторий соответствующим оборудованием, медицинским наблюдением за состоянием здоровья сотрудников, обучением и тренировкой персонала технике безопасности в лаборатории.
Оснащение микробиологических и иммунологических лабораторий Помещения базовой лаборатории должны быть просторными для обеспечения безопасного проведения лабораторной работы. Стены, потолок, пол должны иметь гладкую, легко моющуюся поверхность, непроницаемую для жидкостей, устойчивую к дезинфектантам, обычно используемым в лаборатории. Поверхность рабочих столов должна быть водонепроницаемой, устойчивой к дезинфектантам, кислотам, щелочам, органическим растворителям и умеренному нагреванию. Лабораторная мебель должна быть прочной. Пространство под столами и между мебелью должно быть легкодоступно для уборки. В лаборатории должен находиться автоклав для обеззараживания отходов.
Помещения лаборатории • В число обязательных помещений входят лаборатории кишечных, капельных инфекций, санитарно-бактериологическая, серологическая, а также вспомогательные помещения: средоварка, моечная, стерилизационная (чистая и грязная), регистратура, кладовые, санузел для сотрудников, виварий. В лабораториях с пунктами для обследования на носительство микроорганизмов дополнительно оборудуют приемную, процедурную, туалеты для забора материала. Располагают помещения таким образом, чтобы грязный и чистый потоки не перекрещивались и не соприкасались.
Правила работы в микробиологической лаборатории • запрет работ с пипеткой при помощи рта; • запрет приема пищи, питья, курения, хранения пищи и применения косметических средств в рабочих помещениях; • поддержание чистоты и порядка; • дезинфекцию рабочих поверхностей не реже 1 раза в день и после каждого попадания на них заразного материала; • мытье рук персоналом после работы с заразным материалом, животными, перед уходом из лаборатории; • проведение всех работ таким образом, чтобы свести к минимуму возможность образования аэрозоля; • обеззараживание всех инфицированных материалов перед выбросом или повторным использованием.
Этапы микробиологической диагностики инфекционных болезней 1) Преаналитический этап включает: А) взятие материала для исследования. Материалом для исследования в медицинской микробиологии служат различные биологические и патологические жидкости организма (кровь, гной, моча, мокрота, ликвор, испражнения, рвотные массы, промывные воды и т. п. ) и ткань - материал биопсии от живого или аутопсии от трупа. В санитарной микробиологии на исследование берут объекты окружающей среды (воздух, воду, пищевые продукты и т. п. ) или смывы с них. Общие правила забора материала: • Выбор исследуемого материала определяется патогенезом и клинической картиной инфекционного заболевания • Исследуемый материал берут по возможности в асептических условиях, помещают в стерильную посуду и как можно быстрее доставляют в лабораторию. Иногда допускается непродолжительное хранение материала в регламентированных условиях. • материал берут непосредственно из очага инфекции или исследуют соответствующее отделяемое (гной, мочу, желчь и т. п. ); • количество материала должно быть достаточным для проведения исследования и его повторения в случае необходимости; • материал берут по возможности в начальном периоде болезни, так как именно в этот период возбудители выделяются чаще, их больше, они имеют более типичную локализацию; • материал берут до начала антимикробной химиотерапии или через определенный промежуток времени после приема антибактериального препарата, необходимый для его выведения из организма; • следует предупредить возможность попадания в материал антимикробных препаратов (дезинфектанты, антисептики, антибиотики);
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ Сепсис, бактериемию могут вызывать практически все микроорганизмы, относящиеся к патогенным и условно - патогенным микроорганизмам. Из последних наибольшее значение имеют: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Aerococcus viridans, Pseudomonas aeruginosa; представители родов: Klebsiella, Yersinia, Candida и другие.
• • • 1. Кровь для посева следует брать, соблюдая правила асептики, для того, чтобы избежать попадания микроорганизмов из внешней среды. 2. Посев необходимо проводить во время подъема температуры, в начале появления лихорадки. 3. Кровь для посева следует брать до начала специфического антибактериального химиотерапевтического лечения или, по крайней мере, через 12 -24 часа последнего введения препарата больному (в зависимости от скорости выведения примененного препарата из организма). Следует учитывать также стадию заболевания с тем, чтобы взять кровь для посева в то время, когда предполагается бактериемия (например, при брюшном тифе в первые 10 -15 дней от начала заболевания). 4. Для результативного бактериологического исследования необходимо сеять достаточные количества крови (не менее 10 мл у взрослых и 5 мл у детей) в большое количество жидких питательных сред. Это делается для того, чтобы путем разведения крови (1: 10 - 1: 60) преодолеть естественные бактерицидные свойства крови. Для нейтрализации антибактериальных факторов крови, включая комплемент, рекомендуется, по возможности, применять полианитол - сульфонат натрия 0, 025 -0, 03%. 5. Для взятия крови необходимо пользоваться стерильным шприцем. Системы для одноразового пользования или шприцы, простерилизованные в централизованной стерилизационной, освобождают от упаковки только непосредственно перед употреблением.
• 6. Кровь на посев берут у постели больного или в перевязочной стерильным шприцем или системой для взятия крови одноразового пользования с соблюдением всех правил асептики и засевают тут же у постели больного. Взятие крови и ее посев осуществляют, как правило, два человека. Пока один обрабатывает кожу больного над пунктируемой веной, пунктирует вену и берет кровь, другой - над пламенем спиртовки открывает пробки флаконов, подставляет флаконы со средой под струю крови из шприца или системы, обжигает горлышки и пробки флаконов и закрывает их. • Кожу над пунктируемой веной обрабатывают 70% спиртом, затем 5% настойкой йода, затем снова спиртом. При наличии у больного постоянного подключичного катетера или капельницы в вене можно воспользоваться ими для получения крови. Некоторому количеству крови дают свободно стечь в пробирку (эту кровь можно использовать для биохимических анализов), затем набирают кровь в шприц для посева.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЧИ • Исследование мочи направлено на выделение возбудителя заболевания и на количественное определение степени бактериурии. • Моча здорового человека стерильна. Однако при прохождении через мочеиспускательный канал она может загрязняться вегетирующей в нем микрофлорой. В дистальном отделе уретры в норме обнаруживают следующие микроорганизмы: Staphylococcus epidermidis, Streptococcus faecalis, микроорганизмы семейства и родов: Corynebacterium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae, Bacteroides и некоторые другие виды. • Возбудителями воспалительных процессов в мочевой системе наиболее часто являются условно - патогенные бактерии Escherichia coli, S. faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Citrobacter, Klebsiella pneumoniae, Serratia, несколько реже - Staphylococcus aures, S. epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Mycoplasma. Представители рода Salmonella и семейства Mycobacteriaceae также могут быть выделены из мочи при заболеваниях мочевой системы.
Взятие исследуемого материала • • Исследованию подлежит средняя порция свободно выпущенной мочи, взятой в количестве 3 -5 мл в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Катетеризация мочевого пузыря для рутинного исследования не применяется, так как она может привести к инфицированию мочевых путей. К катетеризации мочевого пузыря прибегают в некоторых случаях для уточнения локализации инфекции - в мочевом пузыре или в почках. С этой целью мочевой пузырь опорожняют катетером и промывают раствором антибиотика, после чего с интервалом в 10 минут берут пробы мочи для исследования. Если инфекция локализуется в почках, микроорганизмы содержатся во всех порциях мочи. При инфекции мочевого пузыря моча остается стерильной. В отдельных случаях делают надлобковую пункцию мочевого пузыря, при которой получают наиболее достоверные результаты. Материал для исследования следует брать до начала антибактериальной терапии или в интервалах между курсами лечения. Содержащиеся в моче микробы быстро размножаются при комнатной температуре, что может дать ложные результаты при определении степени бактериурии. В связи с этим от момента взятия пробы мочи до начала ее исследования в лаборатории должно проходить не более 1 -2 часов при хранении при комнатной температуре и не более суток - при хранении в холодильнике.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОТДЕЛЯЕМОГО ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ • Возбудителями гнойно - воспалительных процессов дыхательных путей чаще всего являются условно - патогенные микроорганизмы следующих родов и видов: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria, Corynebacterium, Klebsiella, Citrobacter, Proteus, Candida, Actinomyces и др. • При направленном исследовании могут быть выделены Mycobacterium tuberculosis и другие микобактерии, Mycoplasma, Bacteroides. • Особенностью микробиологического исследования при инфекциях дыхательных путей является почти обязательное наличие в исследуемом материале нескольких видов микроорганизмов. • В отделяемом зева, трахеи, бронхов, носа в норме обнаруживаются следующие микроорганизмы: Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans, Neisseria, Corynebacterium, Lactobacillus, Candida и некоторые другие. При носительстве могут быть обнаружены S. aureus, S. pneumonia, S. pyogenes. • Мокрота, проходя через верхние дыхательные пути и полость рта, может контаминироваться вегетирующей в них микрофлорой.
Взятие исследуемого материала • • Материалом для изучения этиологии заболеваний дыхательных путей служат: отделяемое зева и носа; мокрота; содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому (у больных, находящихся на аппаратном дыхании); экссудаты; резецированные ткани и др. Материал собирают с соблюдением правил асептики в предварительно простерилизованные баночки или пробирки и доставляют в лабораторию. Хранение материала способствует размножению сапрофитирующей микрофлоры, развитию процессов гниения и брожения, что искажает результаты анализа. Интервал между взятием материала и его посевом не должен превышать 1 -2 часа. Мокрота. Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости. Промывные воды бронхов. При отсутствии или скудном количестве мокроты производят смыв из бронхов физиологическим раствором, однако при этом микробиологическая ценность исследования снижается из-за разведения секрета (часто значительного) и бактерицидного действия раствора на чувствительные микроорганизмы, поэтому нередко концентрация бактерий в бронхиальном содержимом в 10 -1000 раз ниже, чем в мокроте. Кроме того, трудоемкость эндоскопического взятия материала и тяжесть манипуляции для больного ограничивает проведение повторных исследований в динамике заболевания. При бронхоскопии рекомендуется вводить не более 5 мл физиологического раствора с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку. Пунктат инфильтрата или абсцесса легкого. Исследование пунктата наиболее эффективно до прорыва инфильтрата или абсцесса в дренирующий бронх. При трансторакальной пункции получают материал непосредственно из очага поражения и избегают его обсеменения посторонней микрофлорой. Глотка, ротовая полость и нос. Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 часа после еды стерильным ватным тампоном или ложечкой со слизистой оболочки или ее пораженных участков у выходов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном. Тампон осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до его окончания. Для проведения анализов на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки. Материал из носа и глотки берут разными тампонами. При подозрении на клебсиеллы, независимо от места локализации процесса, исследуют материал из носоглотки и обеих половин носовой полости.
Б) оформление бланка-направления - обязательно указываются фамилия, имя, отчество больного, номер истории болезни, клинический диагноз, дата и время взятия материала, характер материала, его источник и точно определяется цель исследования. В) транспортировка в КДЛ - транспортировку материала в лабораторию следует проводить в максимально короткие сроки, в условиях, исключающих гибель неустойчивых видов микробов, или помещать его в специальные транспортные среды, при транспортировке должны соблюдаться все правила биологической безопасности;
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОТДЕЛЯЕМОГО ЖЕНСКИХ ПОЛОВЫХ ОРГАНОВ • • • Вызвать гнойно - воспалительные заболевания полового тракта могут как истинно - патогенные микроорганизмы (Neisseria gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallida, Listeria monocytogenes), так и микроорганизмы условно - патогенной группы, роль которых в последние годы заметно возросла. Наиболее часто из патологического материала выделяют условно - патогенные микроорганизмы родов: Escherichia, Klebsiella, Proteus и других представителей семейства Enterobacteriaceae, а также родов Pseudomonas, Mycoplasma, Streptococcus (гр. D, B), Staphylococcus, Candida и другие. Микробиологическое обследование женской половой сферы представляет определенные трудности, так как нижние отделы полового тракта в норме содержат разнообразную микрофлору, меняющуюся в различные возрастные периоды жизни женщины. Влагалище новорожденных заселяют молочнокислые бактерии, но постепенно они вытесняются кокковой группой (преобладает Staphylococcus epidermidis), которая остается характерной до наступления полового созревания. В менопаузе вновь доминируют микроорганизмы кокковой группы. В репродуктивном возрасте в составе микрофлоры преобладают аэробные молочнокислые бактерии (доминирует группа Bact. Dederleini) в ассоциации с другими сапрофитами. Встречаются следующие виды и роды: Lactobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Corynebacterium, Staphylococcus epidermidis и др
• В процессе родов количество микроорганизмов во влагалище резко уменьшается, происходит самоочищение родовых путей. В первые 2 -3 дня послеродового периода значительно нарастает число бактерий условно - патогенной группы (условия для жизнедеятельности молочнокислых бактерий отсутствуют). В лохиях обнаруживают в большом количестве эпидермальный стафилококк, эшерихии и другие энтеробактерии, микоплазмы, бактероиды, аэробные и анаэробные стрептококки. Постоянно, но не в большом количестве, эти микроорганизмы обнаруживаются и в полости матки. Однако, при гладком течении послеродового периода быстро наступает самоочищение полости матки. • Содержимое цервикального канала в норме стерильно. Лишь у наружного зева в слизисто - гнойной пробке в небольшом количестве могут быть обнаружены микроорганизмы (преимущественно молочнокислые бактерии) как результат обсеменения микрофлорой верхней трети влагалища. • Полость и придатки матки в норме стерильны.
Взятие исследуемого материала • • • Взятие материала для микробиологического исследования проводит врач акушер - гинеколог при подозрении на инфекционную природу патологического процесса. Вульва, преддверие влагалища. Отделяемое берут стерильным ватным тампоном. При воспалении Бартолиниевых желез производят их пункцию, при вскрытии абсцесса железы гной берут стерильным ватным тампоном. Влагалище. После введения зеркала и подъемника материал для исследования берут стерильным ватным тампоном из заднего свода или с патологически измененных участков слизистой. Материал для посева должен быть взят до проведения мануального исследования. Шейка матки. После обнажения шейки матки в зеркалах влагалищную часть ее тщательно обрабатывают ватным тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором или стерильной водой. После этого тонким ватным тампоном, осторожно введенным в цервикальный канал, не касаясь стенок влагалища, берут материал для исследования. Кроме того, для посева может быть использован соскоб слизистой, полученный при диагностическом выскабливании стенок цервикального канала. Матка. Правильное взятие материала из матки может быть выполнено только при использовании специальных инструментов типа шприца - аспиратора, имеющего на зонде покрытие. После прохождения зондом цервикального канала в полости матки раскрывают наружную оболочку зонда и набирают в шприц содержимое матки. После этого закрывают наружную оболочку и зонд выводят из матки. Придатки матки. При воспалительном процессе в придатках матки получение материала из очага инфекции (гной, экссудат, кусочки органов) становится возможным только при оперативном вмешательстве или проведении диагностической пункции опухолевидных образований в малом тазу, проводимой через влагалищные своды. В некоторых случаях острого воспалительного процесса, если очаг инфекции в придатках матки сообщается с полостью матки, полезными могут оказаться повторные исследования отделяемого цервикального канала. При подозрении на анаэробную инфекцию посев должен быть выполнен сразу же после взятия материала путем помещения тампона в пробирку с тиогликолевым полужидким агаром. Параллельно с взятием материала на посев врач акушер - гинеколог готовит мазки для микроскопии (в количестве не менее двух), используя для этого отдельные стерильные тампоны или стерильные гинекологические инструменты. При приготовлении мазков надо равномерно распределить материал на предметном стекле мягкими движениями, не применяя грубого втирания и резких штриховых движений инструментом. Мазок высушивают при комнатной температуре, покрывают чистым предметным стеклом или помещают в чашку Петри и отправляют в лабораторию. Хранение влажного мазка, сдавленного между двумя стеклами, недопустимо. Рекомендуемая техника выполнения мазка позволяет клеткам распределиться слоями, не повреждая их, сохраняет истинное распределение и количественное соотношение компонентов исследуемого материала, дает возможность наблюдать внутриклеточное расположение бактерий (гонококки). Взятый для исследования материал должен быть сразу же отправлен в микробиологическую лабораторию для немедленного посева. При невозможности выполнить это требование взятый материал должен храниться в холодильнике, но не более двух часов.
2) Аналитический этап • Микроскопический метод заключается в приготовлении препаратов (нативных или окрашенных простыми или сложными методами) из исследуемого материала и их микроскопии с применением различных видов микроскопической техники (световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная и др. ). В бактериологии микроскопический метод получил название бактериоскопического, в вирусологии - вирусоскопического.
Достоинствами бактериоскопического метода являются простота, быстрота, экономичность. Однако он находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии какихлибо морфологических или тинкториальных особенностей возбудителя и достаточном его содержании в исследуемом материале. Данный метод является ориентировочным.
• Культуральный метод заключается в посеве исследуемого материала на искусственные питательные среды, культуры клеток или куриные эмбрионы с целью выделения и идентификации чистой культуры возбудителя или возбудителей. В бактериологии культуральный метод получил название бактериологического, в микологии - микологического, в протозоологии - протозоологического, в вирусологии - вирусологического. Штамм – культура микробов, выделенная из определённого источника (организма человека, животного, окружающей среды).
• Основной и самый точный метод диагностики бактериальных инфекций бактериологический, который используют почти при всех заболеваниях, несмотря на его недостатки: длительность исследования (от 4 -5 дней до 2 мес), опасность (так как накапливается чистая культура возбудителя), сравнительную дороговизну. В том случае, если в исследуемом материале предполагается содержание возбудителя в достаточном количестве, посев материала производят на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. При незначительном содержании микробов исследуемый материал прежде засевают на жидкие питательные среды - среды обогащения. Идентификацию выделенной чистой культуры производят по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным и токсигенным свойствам (в зависимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя. С целью эпидемиологического маркирования производят внутривидовую идентификацию выделенной культуры: определяют ее фаговар, биовар и др. Кроме того, для назначения рационального лечения, как правило, определяют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам. При микробиологической диагностике заболеваний, вызванных условнопатогенными микробами, представителями нормальной микрофлоры, обязательным является определение количества возбудителей в исследуемом материале.
• Биологический метод (экспериментальный или биопроба) заключается в заражении исследуемым материалом чувствительных лабораторных животных или других биологических объектов (куриные эмбрионы, культуры клеток). Его используют для выделения чистой культуры возбудителя, определения типа токсина, активности антимикробных химиотерапевтических препаратов и т. д.
Серологический метод заключается в определении титра специфических антител в сыворотке крови больного, реже - в обнаружении микробного антигена в исследуемом материале. С этой целью используются иммунные реакции. Антитела к возбудителю заболевания появляются, как правило, к концу первой недели болезни. Невозможность обнаружить их в первые дни заболевания является серьезным недостатком метода, особенно в тех случаях, когда заболевание протекает остро. Кроме того, при многих болезнях требуются изучение антителообразования в динамике и выявление увеличения количества антител, что также не позволяет быстро поставить диагноз. Недостатком метода является и то, что с его помощью нельзя точно идентифицировать возбудителя и определить его антибиотикограмму. Но в то же время это совершенно безопасный, относительно недорогой метод, позволяющий за короткое время поставить диагноз. В настоящее время при ряде болезней определяют не только количество, но и классы иммуноглобулинов. При некоторых заболеваниях серологический метод применяют для выявления специфических антигенов в исследуемом ма- териале. Поскольку специфические антигены, входящие в состав возбудителя, находятся в патологическом материале с первых минут болезни, этот вариант серологического метода применяют для ускоренной (в течение первого дня болезни) или даже экспрессдиагностики (в течение нескольких часов) инфекционных заболеваний. • Аллергологический метод заключается в выявлении инфекционной аллергии (ГЗТ) на диагностический микробный препарат аллерген. С этой целью ставят кожные аллергические пробы с соответствующими аллергенами. •
Ведущим методом микробиологической диагностики является бактериологический метод, так как он позволяет выделять и идентифицировать микроб-возбудитель, т. е. первопричину болезни. Остальные методы менее информативны, так как они позволяют обнаружить в организменения, обусловленные наличием в нем микроба. Второе место по значимости занимает серологический метод, поскольку взаимодействие антигена и антитела характеризуется высокой степенью специфичности. Информативность трех остальных методов невысокая, и они обычно служат дополнением к бактериологическому и серологическому методам. Так, микроскопия исследуемого материала далеко не всегда позволяет увидеть и идентифицировать микробы под микроскопом. Их удается обнаружить только при высокой обсемененности ими материала. Даже обнаружив бактерии под микроскопом, идентифицировать их до вида морфологически нельзя. Как известно, все видовое многообразие бактерий сводится к 4 основным морфологическим формам: кокки, палочки, извитые и ветвящиеся формы. Поэтому по микроскопической картине можно весьма ориентировочно отнести увиденные бактерии к крупному таксону, например грамположительным коккам. Только в единичных случаях, когда бактерии имеют уникальную морфологию, микроскопически можно определить их родовую принадлежность. Информативность микроскопического метода грибов и простейших выше, так как грибы и простейшие, являясь эукариотами, имеют более крупные размеры и более характерную морфологию.
Диагностические возможности биологического метода ограничены тем, что к большинству возбудителей антропонозных инфекций человека лабораторные животные невосприимчивы, поэтому вызвать у них экспериментальную инфекцию не представляется возможным. Возможности аллергологического метода ограничены тем, что большинство микробов в организме человека не вызывают ГЗТ.
Наряду с традиционными классическими методами микробиологической диагностики в последние годы все большее значение приобретают молекулярно-биологические методы диагностики (ДНК-зонды, ПЦР, лигазная цепная реакция - ЛЦР, хроматография, электрофорез, иммуноблот, биочипы и др. ). Молекулярно-биологические методы диагностики основаны на идентификации ДНК и РНК, специфичных для данного вида микробов, и включают гибридизацию на основе ДНК-зондов и диагностику на основе ПЦР.
Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций В вирусологии методы лабораторной диагностики вирусных инфекций имеют свою специфику, учитывая особенности биологии вирусов. Используются вирусоскопический, вирусологический и серологический методы лабораторной диагностики.
• Вирусоскопический метод заключается в обнаружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще используют электронный микроскоп, реже - люминесцентный. Световая микроскопия из-за ничтожно малых размеров вирусов практически не применяется. Лишь для обнаружения крупных вирусов, используя методы сверхокраски, можно применить световой микроскоп. Кроме того, с помощью светового микроскопа можно выявить внутриклеточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфекциях.
Вирусологический метод заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры клеток), индикации вируса и его последующей идентификации. При заражении лабораторных животных индикация вирусов производится, как правило, по клинической картине болезни, патолого-анатомическим изменениям ориентировочно и окончательно, например, с помощью реакции гемагглютинации. Эта же реакция позволяет выявить вирусы в курином эмбрионе, видимых изменений при вскрытии которого, как правило, не наблюдается. В культуре клеток наличие вируса определяют по цитопатическому действию (в том числе образованию внутриклеточных включений), гемадсорбции, феномену бляшкообразования, реакции гемагглютинации, отсутствию изменения окраски индикатора. Идентификация вируса осуществляется с помощью серологических реакций (РПГА, РСК, ИФА и др. ). Вирусологический метод позволяет точно определить природу возбудителя, но он требует достаточного времени (5 -7 дней и более), значительных материальных затрат и небезопасен.
• Особенностью серологического метода в вирусологии является исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, хранят при температуре 4 -8 С, а вторую сыворотку берут через 10 -14 дней. Сыворотки исследуют одномоментно. О болезни свидетельствует сероконверсия, т. е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностической является сероконверсия в 4 раза и выше. Так как многие вирусные болезни протекают остро, этот вариант серологического метода обычно применяют для ретроспективной диагностики.
Особенности микробиологической диагностики микозов • Для диагностики грибковых инфекций обычно используют микроскопический метод. Микологический метод заключается в по- севе патологического материала на специальные питательные среды, выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Особенностью данного метода является его продолжительность - несколько недель из-за медленного роста грибов. Обнаружение антител при серологическом исследовании возможно со 2 -4 -й нед болезни. При некоторых заболеваниях выявляют специфические антигены в исследуемом материале. Аллергологический метод используют редко. Нередко при микозах применяют гистологический метод, заключающийся в обнаружении элементов гриба (споры, конидиальные головки и т. п. ) в органах и тканях, пораженных грибами. С этой целью готовят гистологические тонкие или ультратонкие срезы тканей, окрашивают их специальными гистологическими и гистохимическими методами и исследуют с применением световой, а в случае необходимости и электронной микроскопии.
Особенности микробиологической диагностики протозойных инфекций • Микроскопическое исследование патологического материала заключается в приготовлении как нативных препаратов ( «толстая капля» ), так и мазков, окрашенных по методу Романовского- Гимзе, и является основным методом диагностики заболеваний, вызванных простейшими. В некоторых случаях применяют серологический и аллергологический методы диагностики.
3. Постаналитический этап микробиологической диагностики заключается в клинической интерпретации результатов лабораторных исследований. При этом лечащий врач должен оценить этиологическое значение выделенных от больного микробов, скорректировать на основании данных микробиологического мониторинга проводимую больному эмпирическую антимикробную химиотерапию и др.
Контроль качества лабораторных исследований Важным элементом работы микробиологической и иммунологической лаборатории является получение точных и сопоставимых результатов анализов, для чего необходимо осуществлять контроль качества проводимых исследований. Контроль качества может быть внутрилабораторным и внешним. Внутрилабораторный контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в отдельной лаборатории персоналом этой лаборатории и направлены на обеспечение соответствующего качественного уровня работы лаборатории. Внешний контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в рамках единой Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) лабораторных исследований группами экспертов и направлены на обеспечение правильной организации технологических процессов производства лабораторных исследований. Федеральная система внешней оценки качества лабораторных исследований состоит из разделов, в рамках каждого из которых выполняется оценка качества определенного вида лабораторных исследований. В структуру ФСВОК входят экспертные группы по разработке и проведению внешнего контроля качества в различных видах лабораторных исследований.
Спасибо за внимание
Скачать презентацию Классификация микроорганизмов Правила работы в микробиологической лаборатории
2 микробиология.pptx