КЛАССИЧЕСКАЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ План

КЛАССИЧЕСКАЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

План: Введение Классическая ПЦР в реальном времени Заключение Список литературы

Введение Полимеразная цепная реакция - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.

Схема ПЦР 1 копия (матрица) Денатурация Отжиг праймеров Синтез 2 копии

Три цикла реакции ПЦР-амплификации ДНК

Классическая ПЦР Полимеразная цепная реакция – метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям.

Состав ПЦР-смеси: 1. ДНК-проба

Состав ПЦР-смеси: 1. ДНК-проба 2. Праймеры

Состав ПЦР-смеси: 1. ДНК-проба 2. Праймеры 3. Нуклеозид-3 -фосфаты

Состав ПЦР-смеси: 1. ДНК-проба 2. Праймеры 3. Нуклеозид-3 -фосфаты 4. Термостабильная ДНКполимераза

Состав ПЦР-смеси: 1. ДНК-проба 2. Праймеры 3. Нуклеозид-3 -фосфаты 4. Термостабильная ДНКполимераза 5. Буфер для ПЦР

Состав ПЦР-смеси: 1. ДНК-проба 2. Праймеры 3. Нуклеозид-3 -фосфаты 4. Термостабильная ДНКполимераза 5. Буфер для ПЦР 6. Ионы Mg 2+

Основные принципы ü ü ü Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом: денатурация ДНК (0, 5 -2 мин) отжиг праймеров (30 сек) элонгация ДНК (7 -10 минут)

Денатурация (94°C) Обеспечивает разделение нитей ДНК Гибридизация (отжиг) праймеров на матрице (45 -65°C) Формирует структуры узнаваемые ДНКполимеразой Синтез (удлинение) цепи (72°C) Происходит синтез комплементарных цепей и удваивает число молекул ДНК мишени

Основные термины и понятия: 1. Праймер 2. Отжиг праймера (annealing) 3. Термостабильная ДНК-полимераза 4. Амплификация ДНК 5. Ампликон

Шаг 1: денатурация ДНК 95 C

Шаг 1: денатурация ДНК 95 C

Шаг 2: отжиг праймеров 40 -50 C

Шаг 3: элонгация цепей 72 C

Шаг 3: элонгация цепей 72 C

Шаг 3: элонгация цепей 72 C

Шаг 3: элонгация цепей 72 C

В результате одного цикла число цепей удвоилось

В следующем цикле новосинтезированные цепи являются матрицами для синтеза новых цепей

95 C

95 C

95 C

40 -50 C

72 C

72 C

72 C

72 C

72 C

72 C

72 C

72 C

72 C

72 C

72 C

72 C

72 C

Число копий вновь удвоилось

В результате 30 циклов получается около 30 2 копий или 1073741824

Определение результатов ПЦР

Результат электрофоретического разделения продуктов ПЦР-реакции.

После электрофореза поместим гель на источник УФ-света — +

ампликоны

Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. Их количество удваивается после каждого цикла до тех пор, пока почти все синтезированные фрагменты не будут соответствовать первоначальному фрагменту, ограниченному праймерами. Циклы нагревания и охлаждения проводятся в термостате-амплификаторе с программируемым температурным режимом.

Приборная база ü ü ü ü амплификатор(или, как его еще называют, термоциклера); система для гель-электрофореза с источником питания (для визуализации результатов ПЦР); система гель-документации(для анализа результатов ПЦР); ПЦР-бокс(для пробоподготовки); вортекс; микроцентрифуга; набор автоматических дозаторов (механических или электронных).

Амплификатор ( термоциклер)

Система для гель-электрофореза с источником питания (для визуализации результатов ПЦР);

Система гель-документации(для анализа результатов ПЦР);

ПЦР-бокс(для пробоподготовки);

Вортекс

Набор автоматических дозаторов (механических или электронных).

Достоинства метода ПЦР ü ü ü Высокая чувствительность исследования Специфичность анализа Универсальность метода ПЦР Экономия времени Эффективность метода ПЦР Широта исследуемого клинического материала

Применение ПЦР ü ü ü клиническая медицина экология судебная медицина и криминалистика фармакология научные исследования (молекулярная биология, генетика)

ПЦР в реальном времени метод, основанный на ПЦР, используется для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК. Метод ПЦР в реальном времени включает в себя одновременно детекцию и количественное определение специфической последовательности ДНК в образце.

Методы детекции результатов ПЦР: ü ü флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК модифицированныеолигонуклеотиды (ДНК-зонды), которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Низкоспецифичная детекция результатов ПЦРРВ с помощью интеркалирующих красителей Детекция продуктов амплификации возможна за счет увеличения флуоресценции интеркалирующего красителя при образовании комплекса с двуцепочечной ДНК. Самый популярный краситель на сегодняшний день - SYBR Green I. Это чувствительный флуоресцентный индикатор двухцепочечной ДНК.

Как работает ПЦР в реальном времени c использованием специфичных зондов? Такой зонд "отжигается" (комплементарно соединяется с ДНК) на участке ампликона между прямым и обратным праймером. На разных концах зонда расположены флуорофор и тушитель флуоресценции этого красителя. Во время процесса амплификации за счет 5`экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата.

Особенность полимеразной цепной реакции в реальном времени - определение накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения реакции. Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют ДНКзонды. В состав ДНК-зонда входит флуоресцентная метка и гаситель флуоресценции. В ходе ПЦР происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к появлению свечения

ПЦР “в реальном времени” имеет ряд значительных преимуществ: Преимущества ПЦР в реальном времени Существенное повышение специфичности метода за счет наличия внутреннего зонда; Возможность количественного определения; Надежность из-за снижения риска контаминации (за счет проведения всех стадий ПЦР в одной пробирке и отсутствия стадии электрофореза); Возможность создания мультиплексных систем, позволяющих детектировать несколько возбудителей в одном образце; Снижение времени проведения реакции; Регистрация и учет данных в электронном формате

Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный амплификатор, отличительной особенностью которого является возможность детектировать флуоресценцию.

Интенсивность флуоресценции измеряется, и результат реакции выносится на экран монитора в виде графика зависимости флуоресценции от количества циклов в реакции. Таким образом, за ходом реакции можно следить уже через несколько минут после её начала Количественное выявление вируса классической чумы свиней в разведениях. Линии выше черной горизонтальной полосы [1, 2, 3, 4, 5] соответствуют положительным результатам; ниже [6] - отрицательным.

Заключение Самое широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявить этиологию инфекции даже если в пробе, взятой на анализ, содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. На сегодняшний день почти нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.

Список литературы: http: //www. lytech. ru/articles_129. htm http: //www. kazedu. kz/referat/185381 http: //ru. wikipedia. org/wiki http: //www. ld. ru/PCR/realtime-pcr. html http: //www. xumuk. ru/biochem/258. html http: //www. narvac. com/prod_dg_real. Time. PCR. htm