Скачать презентацию Кислые значения p H Нейтральные значения p H Скачать презентацию Кислые значения p H Нейтральные значения p H

Лекция 2 Клонирование НК-последовательностей.pptx

  • Количество слайдов: 73

Кислые значения p. H Нейтральные значения p. H Водная фаза (ДНК и РНК) Водная Кислые значения p. H Нейтральные значения p. H Водная фаза (ДНК и РНК) Водная фаза (РНК) Денатурированные белки Фенольная фаза (ДНК)

Сорбция: кислые p. H, высокая ионная сила Элюирование: щелочные p. H, низкая ионная сила Сорбция: кислые p. H, высокая ионная сила Элюирование: щелочные p. H, низкая ионная сила Гуанидинизотиоцианат

p. H 8, 0 p. H 12, 0 p. H 8, 0 Фрагменты линейной p. H 8, 0 p. H 12, 0 p. H 8, 0 Фрагменты линейной ДНК и кольцевая плазмидная ДНК Кольца плазмидной ДНК остаются зацепленными друг за друга Линейная ДНК агрегирует, кольцевая восстанавливается

Eco. RI Линейная Кольцевая ковалентнозамкнутая Релаксированная Eco. RI Линейная Кольцевая ковалентнозамкнутая Релаксированная

Увеличение отношения Et. Br/ДНК Предел визуальной чувствительности – 50 нг ДНК/полоса Релакс Линейная Супер. Увеличение отношения Et. Br/ДНК Предел визуальной чувствительности – 50 нг ДНК/полоса Релакс Линейная Супер. Бромистый этидий

Капилляр - диаметр 50 -100 мкм Быстрое теплорассеяние Флуоресцентный детектор обеспечивает высокую чувствительность Фрагментный Капилляр - диаметр 50 -100 мкм Быстрое теплорассеяние Флуоресцентный детектор обеспечивает высокую чувствительность Фрагментный анализ ДНК Автоматический анализ результатов в реальном времени

1353 72 Время, мин 0 4 8 12 15 1353 72 Время, мин 0 4 8 12 15

Рестрикция хромосом разных штаммов E. coli Хромосомы дрожжей: 2 – S. pombe, 3 – Рестрикция хромосом разных штаммов E. coli Хромосомы дрожжей: 2 – S. pombe, 3 – S. cerevisiae самая большая хромосома ~1, 5 м. п. н.

Хроматография нуклеиновых кислот Хроматография нуклеиновых кислот

Метилтрансфераза Рестриктаза Хеликаза Субстрат ДНК Подчеркнуты метилируемые нуклеотиды Метилтрансфераза Рестриктаза Хеликаза Субстрат ДНК Подчеркнуты метилируемые нуклеотиды

Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной инструмент генной инженерии Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной инструмент генной инженерии

Заполнение ДНК-полимеразой Удаление 3’->5’-экзонуклеазой или S 1 -нуклеазой Заполнение ДНК-полимеразой Удаление 3’->5’-экзонуклеазой или S 1 -нуклеазой

Образование фосфодиэфирной связи между 3’OH- и 5’-фосфатной группами одноцепочечных ДНК Лигирование фрагментов ДНК по Образование фосфодиэфирной связи между 3’OH- и 5’-фосфатной группами одноцепочечных ДНК Лигирование фрагментов ДНК по «тупым» концам

Создание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНК Лигирование по «тупым» концам Расщепление Создание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНК Лигирование по «тупым» концам Расщепление Eco. RI Лигирование по «липким» концам, клонирование

Лигирование по «тупым» концам (димеризации адаптеров не происходит) Фосфорилирование концов вставки Создание новых сайтов Лигирование по «тупым» концам (димеризации адаптеров не происходит) Фосфорилирование концов вставки Создание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНК без использования рестриктаз Лигирование по «липким» концам, клонирование

ДНК-зависимые ДНК-полимеразы ДНК-зависимые ДНК-полимеразы

Свойства, которыми должен обладать любой вектор Свойства, которыми должен обладать любой вектор

Расщепление Xgal β-галактозидазой Расщепление Xgal β-галактозидазой

Promega Promega

Ген глутатион-Sтрансферазы Иммобилизованный глутатион Ген глутатион-Sтрансферазы Иммобилизованный глутатион

5’ 5’ 5’ Лигирование, трансформация 5’ 5’ 5’ Лигирование, трансформация

Векторы на основе хромосомы фага λ Векторы на основе хромосомы фага λ

Штамм 1 Штамм 2 Лизогенные штаммы E. coli Смесь экстрактов клеток двух штаммов содержит Штамм 1 Штамм 2 Лизогенные штаммы E. coli Смесь экстрактов клеток двух штаммов содержит все компоненты капсида фага λ Жизнеспособный фаг λ

Инсерционный вектор лямбда gt 10 Инсерционный вектор лямбда gt 10

Sau 3 A: ↓GATC Bam. HI: G↓GATCC Sau 3 A: ↓GATC Bam. HI: G↓GATCC

>2000 т. п. н. >2000 т. п. н.

Митоз в клетках человека. Микротрубочки – зеленые, ДНК – голубая, кинетохоры красные Митоз в клетках человека. Микротрубочки – зеленые, ДНК – голубая, кинетохоры красные

Евгений Витальевич Ананьев, 1970 -е Искусственные хромосомы кукурузы Первооткрыватель мобильных генетических элементов у дрозофилы Евгений Витальевич Ананьев, 1970 -е Искусственные хромосомы кукурузы Первооткрыватель мобильных генетических элементов у дрозофилы

20 -300 копий на клетку. Стабильно распределяются между дочерними клетками. 20 -300 копий на клетку. Стабильно распределяются между дочерними клетками.