КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ l l l Основные понятия

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ l l l Основные понятия Михаэлис-Ментен Типы ингибирования

Биохимическая кинетика Задачей кинетики является определение сродства фермента к субстрату или ингибитору, а также скоростей биохимических реакций и их максимальных значений. Это необходимо для решения задач фармакологии, основными из которых являются разработка новых лекарств, подбор их дозировки и определение индивидуальной чувствительности.

Скорость реакции - количество продукта (или субстрата), образовавшегося (или распавшегося) в единицу времени А молекулярность реакции порядок реакции P A+А или А v = k[А] P P [A], % начальная скорость время (количество вступающ реакци v = k[А]2 v = k 1[А]-k-1[P]

Неферментативная vs. ферментативная реакции E S S P максимальная скорость ES P

Кинетика Михаэлиса-Ментен (модель Бригса. Холдейна) S+E k+1 k-1 ES k+2 P+E УСЛОВИЯ : 1. Избыток субстрата (S >> E) 2. Начальное состояние (нет k-2 и [P]=0 ) 3. Фермент-субстратный комплекс (ES) 4. Равновесное состояние (ES=const)

Уравнение Михаэлиса-Ментен S+E k+1 k-1 ES k+2 P+E ES = constant Скорость образования ES = Скорость распада ES = Km Скорость суммарной реакции в которой [S] [ET] Vmax

Физический смысл кинетических параметров Максимальная скорость – это тогда, когда весь фермент находится в комплексе с субстратом Константа Михаэлиса характеризует сродство фермента к субстрату (равна концентрации субмтрата, при которой скорость – 1/2 Vmax v [S] Если известна концентрация фермента [ET], то можно вычислить kcat - число оборотов фермента Единицы международная = 1 мкмоль продукта / мин активности единица фермента = 1 моль субстрата / сек катал

Эффективность фермента Соотношение kcat/Кm можно рассматривать как показатель эффективности данного фермента

Линеаризация: определение Km и Vmax y = ax + b

Эффект р. Н и температуры Q 10 ≈ 2

Ингибиторы ферментов НЕОБРАТИМЫЕ и ОБРАТИМЫЕ НЕКОНКУРЕНТНЫЕ и КОНКУРЕНТНЫЕ

Конкурентные и неконкурентные ингибиторы

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ Концентрационная Метаболитами Генетический контроль Посттрансляционные модификации Аллостерическая

Стратегии регуляции активности ферментов 1. За счет концентраций субстрата/продукта 2. Под действием метаболитов 3. При помощи ковалентной модификации 4. Белок-белковыми взаимодействиями 5. Аллостерически 6. Ограниченным протеолизом 7. Изменением уровня экспрессии 8. Изменением изоформного состава

Основной принцип регуляции метаболитами Регулируется первая необратимая стадия процесса

Обратные связи и регуляторные петли Ф 3 Ф 2 Ф 1 А субстрат метаболит 1 продукт Б рецептор передатчик мишень регулятор Ф 5 В регулятор рецептор передатчик Ф 4 передатчик мишень

Боковые петли Окисление Фосфорилирование

Варианты ковалентной модификации Неддилирование Убиквитинирование Ацетилирование Сумоилирование Метилирование NH 3+ Фосфорилирование Гликозилирование Биотинилирование OH S/T СH 2 Гидроксилирование 6 К 11 К СH 2 К ADP-рибозилирование Метилирование OH O С D/E Фосфорилирование Сульфатирование Нитрозилирование 27 К 29 К 33 К 48 К убиквитин 63 К O Y К белок-мишень

Множественная модификация ключевых белков M A M A Гистон Н 3 A M M ARTKQTARKSTTGGKAPRKQLATKAARK S M P M M P р53 P P P P Активация транскрипции A P A P Регуляторный ДНК-связывающий NLS Тетрамеризация домен U U S

Узнавание модифицированных остатков Src PDGFR-b P P Внеклеточный домен Pin 1 Cdc 25 C PI 3 K GAP P P ТМ Plk 1 P SHP P Цитоплазматический домен Pin 1 P P P Фосфатаза NES PLC P

Модульные элементы сигнальных белков участки модификации пептидные нуклеотидны последовательности домен-доменные взаимодействия фосфолипидные взаимодействия Pawson & Nash (2003) Science 300: 445 -452

Адаптерные белки и взаимодействия

Структура сигнал-передающих систем клетки Р Р П 1 П 2 П 3 М 1 М 2 O П. . . + П 1 П 2 Р П 2 П 3 М O = П 7 П 4 П 8 П 5 П 9 П 6 П 3 М 1 М 2 O

Аллостерическая регуляция Активация ц. АМФ-зависимой протеинкиназы Связывание кислорода миоглобином и гемоглобино

Ограниченный протеолиз

Активация химотрипсиногена

Конститутивные и индуцибельные изоформы Эффект тиреоидных гормонов

МИОГЛОБИН И ГЕМОГЛОБИН l l Транспорт кислорода Структура, гем и связывание кислорода Регуляция и аллостерия Изоформы и патология

Аллостерическая регуляция Аллостерические ферменты : 1. Не подчиняются кинетике Михаэлиса-Ментен, есть кооперативность 2. Есть аллостерический центр, отличный от каталитического 3. Прямые и обратные (feedback) аллостерические регуляторы 4. Часто имеют олигомерную структуру

Структура миоглобина и гемоглобина миоглобин гемоглоби н 1 -ная структура очень сходная 2 -ная структура одинакова 3 -ная структура 4 -ная структура одинакова нет есть аллостерия нет есть O 2 да ДА Fe 2+, гем да да CO 2 нет (да) 1, 2 -БФГ нет да

Связывание кислорода F E 0, 55 Å 0, 26 Å Кислород > железо > прокси-гистидин > сдвиг α-спирали > аллостер

Связывание окиси углерода дистальный гистидин проксимальный гистидин относительно е сродство 25 000 250 1

Аллостерия гемоглобина

Транспорт кислорода

Эффект Бора: р. Н и СО 2 изменяют связывание О 2

2, 3 -Бисфосфоглицерат регулирует связывание О 2

Фетальный гемоглобин Hb: α 2β 2 Hb F: α 2γ 2 2, 3 -БФГ связан с β 2, 3 -БФГ хуже связывает γ

Двусубстратные реакции Могут быть двух типов Последовательные, или единозамещающие (singledisplacement) Random (креатинкиназа) Ordered (НАД+-зависимые ДГ) Пинг-понг, или двузамещающие (double-displacement) (аминотрансферазы)