Картирование генома 1 Генетические и физические карты

Картирование генома 1

Генетические и физические карты По общепринятой классификации методы картирования геномов подразделяют на две категории: p Генетическое картирование p Физическое картирование 2

Составление генетических карт p p Маркёры – позиции каких-либо отличительных признаков. В качестве маркёров на протяжении десятилетий использовались гены, определяющие легко различимые фенотипы. Для более сложных карт использовались в качестве фенотипических признаков организма его биохимические особенности. Карта, основанная на генах, не может быть очень подробной. Также только часть всего числа генов существует в удобно различимых аллельных формах. 3

ДНК-маркёры ДНК–маркёры – нанесённые на карту особенности, которые не являются генами. Всякий пригодный ДНК–маркёр должен иметь два аллеля, как и ген–маркёр. Этому требованию удовлетворяют три типа особенностей последовательности ДНК: -Полиморфизмы длины фрагментов рестрикции (RFLP); -Полиморфизмы длины простых последовательностей (SSLP); -Полиморфизмы отдельных нуклеотидов (SNP). 4

1 ДНК-маркёр. Полиморфизмы длины рестриктов RFLP – первый тип ДНК-маркёров, который был полностью изучен. Ферменты рестрикции разрезают ДНК в определённых сайтах узнавания. Эта специфичность означает, что обработка молекулы ДНК ферментом рестрикции должна производить один и тот же набор фрагментов. С молекулами геномной ДНК так происходит не всегда, так как некоторые участки рестрикции полиморфны и существуют в виде двух аллелей: один показывает правильную последовательность для участка рестрикции и потому разрезается ферментом при обработке ДНК, а второй аллель несёт видоизменение последовательности, так что участок рестрикции уже не опознаётся. В результате этого два смежных фрагмента 5 рестрикции остаются связанными вместе, что

Полиморфизмы длины рестриктов 6

Визуализация RFLP 1. Гибридизация по Саузерну с использованием зонда, который покрывает полиморфный участок рестрикции 7

Визуализация RFLP 2. ПЦР используется гораздо чаще. Затравки для ПЦР разрабатываются таким образом, чтобы они отжигались к обеим сторонам полиморфного участка, и RFLP типизируется путём обработки размноженного фрагмента ферментом рестрикции и последующего пробега образца в агарозном геле. 8

2 ДНК-маркёр. Полиморфизмы длины простых последовательностей SSLP – множества повторных последовательностей, которые показывают изменения длины; различные аллели содержат разное число повторных единиц. Существуют SSLP двух типов: минисателлиты и микросателлиты. Два варианта некоторого STR (микросателлита) с повторяющейся последовательностью GA 9

Типы SSLP Минисателлиты (переменное число тандемных повторений, или VNTR). Повторная единица может иметь длину до 25 п. н. 2. Микросателлиты (простые тандемные повторения, или STR). Повторяющийся элемент – 13 п. н. или меньше. 1. 10

Типы SSLP ДНК-маркёры, основанные на микросателлитах, более популярны, чем основанные на минисателлитах, по двум причинам: -Минисателлиты неравномерно распределены по всему геному, чаще встречаются в теломерных областях на концах хромосом, микросателлиты более равномерно распределены в геноме. -точная типизация полиморфизма длины путём ПЦР возможна при длине последовательностей не более 300 п. н. , а большинство минисателлитных аллелей 11

3 ДНК- маркёр. Полиморфизмы отдельных нуклеотидов SNP – это позиции генома, в которых некоторые индивидуумы имеют один нуклеотид, например, G, а другие имеют отличающийся от него нуклеотид – С. 12

Большинство SNP имеют 2 аллеля, поскольку SNP возникают, когда в геноме происходят точечные мутации, преобразовывающие один нуклеотид в другой. Если подобная мутация случится в репродуктивных клетках, то один или более его потомков могут унаследовать эту мутацию, и в итоге SNP станет закреплённым в популяции. 13

Методы типизации SNP Методы базируются на анализе гибридизацией олигонуклеотидов. -Технология чипов ДНК - Методы гибридизации в растворе - Анализ лигированием олигонуклеотидов (OLA) - Система размножения термостабильных мутаций, или тест ARMS. 14

Методы типизации SNP Технология чипов ДНК На поверхность стеклянной пластины площадью 2 см 2 с множеством различных олигонуклеотидов пипеткой наносится предназначенная для тестирования ДНК, помеченная флюоресцентным маркёром. Гибридизация детектируется путём анализа чипа с помощью флюоресцентного микроскопа. Позиции, в которых испускается флюоресцентный сигнал, показывают, какие олигонуклеотиды 1. 15

Методы типизации SNP 2. Метод гибридизации в растворе Используется пара меток, в которые входит флюоресцентный краситель и вещество, гасящее флюоресцентный сигнал при сближении с испускающим его красителем. Краситель прикрепляется к одному концу олигонуклеотида, гасящее вещество – к другому концу. Если между олигонуклеотидом и тестируемой ДНК происходит гибридизация, то данное спаривание оснований нарушается, гаситель отрывается от красителя, и тот вырабатывает флюоресцентный сигнал. 16

Методы типизации SNP 3. Анализ лигированием нуклеотидов (OLA) Применяются два олигонуклеотида, которые отжигаются смежно другу, при этом 3’-конец одного из них точно попадает в SNP. Этот олигонуклеотид образует полностью спаренную основаниями структуру, если в матричной ДНК присутствует одна версия SNP, и когда это происходит, данный олигонуклеотид может быть 17

Методы типизации SNP 4. Система размножения термостабильных мутаций (тест ARMS) Контрольным олигонуклеотидом выступает одна из пары затравок ПЦР. Если контрольная затравка отжигается к SNP, то он может быть продолжен с помощью полимеразы Taq и ПЦР может иметь место, но если она не отжигается из-за того, что присутствует альтернативная версия SNP, то никаких продуктов ПЦР не 18

Сцепление генетических признаков Генетическое картирование основано на законах наследственности, описанных Грегором Менделем ещё в 1865 году. Помимо первых двух законов Менделя, встречаются ещё два случая необычного сцепления: -Неполное доминирование (гетерозиготная форма проявляет фенотип, промежуточный между двумя гомозиготными формами); -Кодоминирование (гетерозиготная форма показывает оба гомозиготных фенотипа) 19

Определяющий шаг в развитии генетического картирования Когда в 1900 году законы Менделя были переоткрыты, выяснилось, что полное сцепление, которое ожидалось между многими парами генов, не осуществилось. Пары генов или наследовались независимо, или показывали лишь неполное сцепление: иногда наследовались вместе, иногда порознь. p Разрешение этого противоречия и стало решающим шагом в развитии составления генетических карт. p 20

Рассуждения Томаса Моргана Неполное сцепление объясняется поведением хромосом во время мейоза. p Процесс кроссинговера (или рекомбинации) был открыт бельгийским цитологом Янсеном в 1909 году и помог Моргану объяснить неполное сцепление. Рассмотрим эффект, который имеет кроссинговер на наследование генов. p 21

Эффект кроссинговера Имеется два возможных сценария: p Между генами А и В не происходит кроссинговер. Тогда две гаметы имеют генотип АВ, две другие – аb. p Между генами А и В происходит кроссинговер. Это приводит к обмену сегментами ДНК между гомологичными хромосомами. В итоге каждая гамета имеет отличный от других генотип: AB, a. B, Ab и ab. Помимо гамет с родительскими генотипами появляются гаметы с 22

Составление генетических карт Когда Морган объяснил неполное сцепление кроссинговером, он изобрёл способ наносить на карту отдельные позиции генов в хромосоме. Допустим, кроссинговер является случайным событием, а значит, может произойти в любой позиции на протяжении пары вытянутых одна вдоль другой хроматид. Если это верно, то два гена, расположенные близко друг к другу, будут разделяться кроссинговерами реже, чем гены, лежащие дальше друг от друга. Частота, с которой гены разъединяются кроссинговерами, будет прямо пропорциональна отдалению их друг от друга. Поэтому частота рекомбинации является мерой расстояния 23

Анализ сцепления генетических признаков у организмов различного типа. Включает три ситуации: p Анализ сцепления генетических признаков у видов наподобие плодовой мушки и мыши, с которыми можно выполнять эксперименты по скрещиванию; p Анализ сцепления генетических признаков у людей, с которыми нельзя проводить эксперименты, но можно изучать родословные; p Анализ сцепления генетических признаков у бактерий, которые не 24

Анализ сцепления генетических признаков при возможности проведения скрещивания Метод основан на анализе потомства от экспериментальных скрещиваний, при известных генотипах родителей. Обычно используется анализирующее скрещивание. Этот метод применим ко всем эукариотам, но неприменим к человеку из этических соображений. 25

Составление генетической карты на основе анализа родословной человека Зачастую из-за соблюдения научной и медицинской этики учёные могут оперировать лишь скудными данными, так как браки редко дают удобное анализирующее скрещивание, и генотипы многих членов семей могут быть неизвестны ввиду смерти или нежелания сотрудничать. Обыкновенно, чтобы решить необходимую генетическую задачу, достаточно знать дополнительно генотип хотя бы одного родственника, но по разным причинам это невозможно. 26

Составление генетических карт бактерий Главная трудность состоит в том, что бактерии гаплоидны и не подвергаются мейозу. Поэтому используются три способа, способные вызвать кроссинговер: p В процессе коньюгации происходит передача эписомы (сегмент хромосомной ДНК длиной до 1 млн. п. н. ) p Трансдукция (передача фрагмента ДНК длиной до 50 тыс. п. н. через бактериофаг) p Трансформация (клетка-реципиент 27

Составление физических карт Полученная исключительно генетическими методами карта не будет полностью точна. Это обусловлено следующими причинами: 1. Разрешение генетической карты зависит от числа кроссинговеров, которые были набраны. Для микроорганизмов это не главная проблема, поскольку они могут быть получены в любом количестве. Проблема с людьми и другими эукариотами в том, что невозможно получить большое число потомков, так как может быть изучено сравнительно 28

Составление физических карт 2. Генетические карты имеют ограниченную точность. На картинке изображено сравнение физической и генетической карт дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Сравнение показывает, что порядок двух верхних маркёров на генетической карте неверен и также есть различия в относительном 29

Методы физического картирования Рестрикционное картирование p Флюоресцентная гибридизация p Картирование меченых участков последовательности p 30

Составление рестрикционных карт Простейший способ составления рестрикционной карты – сравнение размеров фрагментов, полученных при переваривании молекулы ДНК двумя разными ферментами рестрикции. Выбрать единственно верную карту позволяет дополнительная обработка исходной ДНК одним ферментом с предотвращением протекания переваривания до конца. Это называется частичной рестрикцией. Масштаб рестрикционной карты ограничивается длиной рестриктов. Рестрикционное картирование более приемлемо для маленьких молекул. 31

Составление рестрикционных карт Возможно ли использование рестрикционного анализа для картирования геномов размером более 50 тыс. п. н. ? Да, ограничения рестрикционного картирования могут быть ослаблены за счёт подбора ферментов, которые имеют редкие участки разрезания в целевой молекуле ДНК ( «редкощепящие рестриктазы» ) 32

Метод OFAGE Электрофорез в геле с ортогонально чередующимся полем. Таким образом, каждое изменение поля вынуждает молекулы перестраиваться, короткие молекулы перестраиваются и Электрическое поле чередуется мигрируют через гель между двумя парами быстрее длинных. За счёт электродов, каждая из которых такого приёма позволяются помещена по углом 45° к более длинные фрагменты, продольной линии геля. чем при обычном электрофорезе. К подобного рода методам относят также CHEF – электрофорез в геле с однородными электрическими полями и 33 FIGE – электрофорез в геле с обращением поля.

Непосредственное наблюдение участков рестрикции в молекулах ДНК. Для нанесения на карту участков рестрикции можно использовать методы, не связанные с электрофорезом. p Метод оптического картирования: позиции участков рестрикции определяются путём непосредственного наблюдения разрезанных молекул ДНК в микроскоп. Для закрепления ДНК на предметном стекле используют вытягивание гелем и расчёсывание молекул. p Для вытягивания гелем хромосомную ДНК переводят во взвесь в расплавленной агарозе и помещают на предметное стекло микроскопа. По мере охлаждения и затвердевания геля молекулы ДНК вытягиваются. p Для расчёсывания волокна ДНК приготовляют путём погружения покрытого силиконом покровного стекла в раствор ДНК, выдерживая его там в течение 5 минут. Далее вынимают стекло из раствора. Сила, необходимая для 34 протягивания ДНК через поверхностный мениск, заставляет каждую из них вытягиваться в линию. При засыхании ДНК

Оптическое картирование 35

Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) В этой методике маркёром является последовательность ДНК, которая отображается путём гибридизации с флюоресцентным зондом. Ненарушенная хромосома исследуется путём её зондирования меченой молекулой ДНК. Для работы метода ДНК в хромосоме денатурируется( высушивается на предметном стекле и обрабатывается 36

FISH в действии 1. 2. Первоначально метод использовался с метафазными хромосомами, но их сильная уплотнённость не позволяла составлять карты с высокой разрешающей способностью. В 1995 году был разработан ряд методов FISH более высокого разрешения. Оно достигалось за счёт изменения характера изучаемого хромосомного аппарата. Если метафазные хромосомы слишком сжаты для крупномасштабного картирования, то нам следует использовать хромосомы в более вытянутом виде. Добиться этого можно двумя способами. Механически вытянутые хромосомы могут быть получены за счёт изменения метода приготовления препарата, применяемого для выделения хромосом из метафазных ядер. Неметафазные хромосомы используются, потому что во всех стадиях клеточного цикла, кроме метафазы, хромосомы пребывают в естественном для них 37 развёрнутом состоянии. Интерфазные хромосомы

Картирование с помощью меченых участков последовательности (STS) В настоящее время это самый мощный метод физического картирования. Меченый участок последовательности, или STS – короткая последовательность ДНК, 100 -500 п. н. в длину, которая легко опознаётся и лишь единожды встречается в хромосоме или изучаемом геноме. Чтобы нанести на карту набор STS, необходимо располагать множеством перекрывающихся фрагментов ДНК из отдельной хромосомы или полного генома. Какие фрагменты содержат какие STS, определяется методом гибридизационного анализа, или, чаще, ПЦР. Любая уникальная последовательность ДНК может быть использована в качестве STS. Для этого последовательность ДНК должна быть известна , а STS должен иметь уникальное 38 местоположение на изучаемой хромосоме.

Методы получения STS 1. 2. 3. Ярлыки экспрессируемых последовательностей – короткие последовательности, получаемые анализом клонов к. ДНК. Полиморфизмы длины простой последовательности (SSLP) Случайные геномные последовательности – получают секвенированием случайных частей клонированной геномной к. ДНК. 39

Фрагменты ДНК для картирования с помощью STS Иначе реактив для картирования; существуют в виде библиотеки клонов и радиационных гибридов. Радиационный гибрид – клетка грызуна, содержащая фрагменты хромосом другого организма. При разбиении хромосомы на фрагменты большая доза излучения давала большее число фрагментов. Слияние стимулируется химически (полиэтиленгликолем) или биологически – вирусом Сёндай. 40

Выводы p p p Карты геномов – опорная схема для проектов секвенирования, так как они позволяют проверять точность собранной последовательности ДНК. Генетические карты строят по результатам экспериментов по скрещиванию и анализа родословных, физические карты – посредством прямого наблюдения молекул ДНК. В самых первых генетических картах маркёрами выступали гены, аллели которых можно было легко отличать (по резко отличным фенотипам), ныне же ДНК-маркёрами являются полиморфизмы длины фрагмента рестрикции (RFLP), полиморфизмы длины простой последовательности (SSLP) и полиморфизмы отдельных нуклеотидов (SNP). Все они легко типизируются посредством ПЦР. Анализ сцепления генетических признаков позволяет определить частоту рекомбинации между парой маркёров. Для многих организмов анализ сцепления генетических признаков прослеживается при помощи запланированных 41 экспериментов по скрещиванию. С людьми их проведение

Выводы p p p Генетическое картирование генома человека опирается на сведения, почёрпнутые из анализа родословной. Низкое разрешение генетических карт уточняется физическим картированием. В молекуле ДНК позиции участков рестрикции определяются рестрикционным картированием. Флюоресцентная гибридизация более продуктивная, в ней препарат зондируется маркёром, меченным флюоресцентной меткой. Позиция гибридизации определяется микроскопированием. Наиболее подробные физические карты получаются методом картирования содержания меченых участков последовательности (STS). Позиция маркёра на карте определяется фрагментами из коллекции, содержащими копии маркёра. 42