Кариес и гингивит Мониторинг резистентности анаэробных бактерий полости

Кариес и гингивит Мониторинг резистентности анаэробных бактерий полости рта к антимикробным химиопрепаратам Проф. В. Н. Царев, В. М. Червинец

Распространенность кариеса зубов и воспалительных заболеваний пародонта в нашей стране достигает 95 – 100 %

Факторы риска развития кариеса Кариес зубов Кариесогенные бактерии Биоплёнка зуба Бактерииантагонисты Резистентность эмали (Сa, P, F, Sr, Zn > Se, Cd, Pb, Mg) Streptococcus mutans Streptococcus sanguis Actinomyces spp. Lactobacillus spp. * Veillonella parvula Veillonella alcalescence Neisseria spp. *

Содержание фторида в питьевой воде в различных территориях Российской Федерации Низкое содержание фторида в воде (менее 0, 5 ммоль/л) Субоптимальное содержание фторида в воде (0, 5 -1 ммоль/л) Высокое содержание фторида в воде (более 1 ммоль/л) Наличие водоисточников с высоким и низким содержанием фторида

КАРИЕСОГЕННЫЕ ВИДЫ: 1. Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis 2. Actinomyces odontolyticus, Actinomyces spp. 3. Lactobacillus spp. ВИДЫ-АНТАГОНИСТЫ: 1. Veillonella alcalescence 2. Veillonella parvula 3. Neisseria spp. ГЛИКАНЫ – резервные полисахариды биоплёнки, которые используются кариесогенными бактериями в ночное время

Биоплёнка зуба Накопление углеводов Резистентность эмали Респираторный взрыв с активным выделением органических кислот Дефицит фосфатов в результате их утилизации бактериями в процессе гликолиза

Морфология стрептококков

Электронная микроскопия стрептококков

Стрептококки при росте в сахарном бульоне с кровью

Гемолиз на кровяном агаре

Бета-гемолитические колонии S. milleri на кровяном агаре

Актиномицеты

Рост чистой культуры Actinomyces israeli на кровяном агаре.

Микробиологические аспекты этиологии и диагностики воспалительных заболеваний пародонта

Зубо-десневой желобок Грам-отрицательные бактерии – пародонтопатогены 1 порядка: • 1. Actinobacillus actinomycetemcomitans • 2. Bacteroides forsithus • 3. Porphyromonas gingivalis • 4. Prevotella intermedia • 5. Treponema denticola Грам-отрицательные бактерии – пародонтопатогены 2 порядка: • 1. Eikenella corrodens • 2. Fusobacterium spp. • 3. Wolinella recta Грам-положительные бактерии – пародонтопатогены 2 порядка: • • • 1. Peptostreptococcus micros 2. Actinomyces spp. 3. Streptococcus intermedius

Prevotella в мазке

Мазок из чистой культуры бактероидов

Превотеллы на кровяном агаре

Фузобактерии (окраска по Граму)

Препарат из чистой культуры Fusobacteriun nucleatum

Фузобактерии на кровяном агаре

Фузобактерии на селективной среде

Фузобактерии и трепонемы в пародонтальном кармане

Структуры периодонта

Факторы предрасполагающие к развитию заболеваний пародонта. Экзогенные Эндогенные Наследственность

Экзогенные факторы. • • • Неудовлетворительная гигиена полости рта Длительный стресс Хр. интоксикации Фармакологические препараты Алиментарный фактор Экология

Эндогенные факторы • Соматичскеие заболевания: а) Сердечно-сосудистые заболевания (ИБС, гипертоническая болезнь и т. п. ) б) Эндокринные заболевания (сахарные диабет, заболевания щитовидной железы и т. п. ) в) Заболевания крови (лейкоз, анемия) г) Онкологические заболевания • Иммунологические нарушения • Носительство пародонтопатогенных бактерий

Наследственность • • • Даун синдром Трисомия 21 Папилон-Лефевре синдром

Патогенетические механизмы • • • Бактериологическое повреждение Иммунологическое повреждение Другие механизмы повреждения тканей пародонта (нарушение гормонального обмена, нарушение минерального обмена)

Повреждение тканей пародонта.

Бактериальные пародонтопатогены. • 1 группа: пигментообразующие бактероиды: • Bacteroides forsithus , Prevotella intermedia , Porphyromonas gingivalis ; • 2 группа: прочие грам-отрицательные анаэробные бактерии: • • Actinobacillus actinomycetemcommitans , Fusobacterium. , Eykenella spp corrodens , Treponema denticola , Wollinella ; recta • 3 группа: грам-положительные анаэробные бактерии: • Actinomyces naeslundii , A. israelii A. viscosus , , Peptostreptococcus , Streptococcus micros intermedius

Fusobacterium necroforum, Prevotella intermedia

Бактериальное повреждение тканей при воспалительных заболеваниях пародонта • Адгезины (пили, микрокапсула) • Ферменты (гиалуронидаза, фосфолипаза, протеаза и др. ) • Токсины (эндотоксины клеточной стенки Грбактерий)

Методы микробиологической диагностики • • Микроскопический (включая биоптаты) Бактериологический (анаэробиоз) Серологический (ИФА, РИФ)* Биологический (выявление экзотоксинов)* • Молекулярно-генетический (ПЦР)

Взятие материала для исследования: а) тампоном; б) гладилкой; в) адсорбером

Транспорт исследуемого материала - бак. метод • Соблюдение правил взятия исследуемого материла. Предотвращение контаминации образца. Уменьшение доступа кислорода. • Использование транспортных систем и сред тормозящих активную жизнедеятельность анаэробных видов бактерий (тиогликолевая среда, среда Стюарта, Среда Эймса и т. п. ). • Доставка материала в ближайшие часы после взятия пробы, охлаждение при 4 С до посева

Микроскопический метод: преобладание грамотрицательной флоры – неблагоприятный показатель состояния тканей пародонта • Грам-отрицательные спиралевидные бактерии, анаэробы-микроаэрофилы

Алгоритм бактериологического исследования с применением анаэробного культивирования: 1 -получение изолированных колоний в условиях анаэробиоза на 5% гемин-агаре 2 -идентификация чистых культур по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам 3 -чувствительность к антибиотикам

Современная диагностика: ПЦР (генетич. маркеры) ИФА (антитела)

Micro Dent. R (Hain Diagnostica, Германия)

Молекулярно – биологические методы • ПЦР – разработана и запатентована отечественная система «Мульти. Дент» • Масс-спектрометрия 16 S рибосомальных белков на аппаратном комплексе «Микро. Флекс» ( «Броккер Дальтоникс» , Германия).

Забор пробы материала для постановки ПЦР с помощью тест-систем Мульти. Дент (Россия), Микро. Дент (Германия)

Микроскопия препарата из чистой культуры Porphyromonas gingivalis

Микроскопия препарата из чистой культуры Fusobacterium nucleatum

Микроскопия препарата из чистой культуры Fusobacterium mortiferum

Микроскопия чистой культуры Peptostreptococcus intermedius

Микроскопия препарата из чистой культуры Аctinomyces israelii

Основные группы резидентов полости рта: 1. Стрептококки 50% - грам+, гамма и альфа-зеленящие в том числе: вирулентные – бета-гемолитические* 2. Дифтероиды 25% - грам+, коринебактерии, лактобактерии, в том числе: актиномицеты*, пропионибактерии* 3. Вейллонеллы 20% - грам-, антагонисты стрептококков 4. Бактероиды - грам-, фузобактерии, в том числе, превотеллы*, порфиромонады*, 5. Извитые (спиралевидные) формы анаэробных бактерий

Основные пародонтопатогены из группы бесспоровых анаэробов: • Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans, серотипы а, b • Tannerella forsithia (Bacteroides forsithus) • Porphyromonas gingivalis • Prevotella intermedia • Treponema denticola

старт P. i. (1000 п. н. ) B. f. (700 п. н. ) T. d. (512 п. н. ) A. a. (360 п. н. ) P. g. (197 п. н. ) финиш Детекция продуктов амплификации методом гельэлектрофореза К+ 1 2 3

RTX – лейкотоксин актинобациллы • • Itx. C- кодирует активацию первичного продукта Itx. A - кодирует сам токсин Itx. B, Itx. D - кодируют протеины внутриклеточного транспорта У нетоксигенных штаммов серотипа а отсутствуют основные нуклеотидные пары на промоторном участке и продукция токсина резко снижена (в 20 -30 раз) по сравнению с токсигенным серотипа b

Трудности выявления пародонтопатогенной флоры: • Необходимость и длительность анаэробного культивирования (5 суток) • Высокая требовательность к составу питательных сред • Отсутствие методов идентификации, доступных для клинических лабораторий • Внутриклеточная локализация порфиромонад, превотелл, актинобацилл, хламидий

Способность к внутриклеточному паразитизму - персистенция в условиях антибиотикотерапии: Porphyromonas gingivalis в десневом эпителии

Факторы вирулентности Длительное воспаление Разрушение тканей десны и альвеолярного отростка Кровоточивость Нарушение сосудистой микроциркуляции крови в тканях десен Дистрофические изменения Рассасывание костной основы. Выпадение зубов

Только молекулярно-генетическим методом (ПЦР) выявляются: 58, 3% 52, 7%

Определение чувствительности анаэробов крайне трудоёмко: 1) метод дисков

2) Кассетный микрометод (1991 г) • линкосамиды (линкомицин, клиндамицин); • макролиды (рокситромицин, спирамицин, кларитромицин, мидекамицин); • производные имидазола (метронидазол, нитазол, тинидазол) в комбинации с бета-лактамами • фторхинолоны 4 поколения

Динамика количества резистентных штаммов анаэробных бактерий (в %) за 1985 -2005 гг. по данным кафедры микробиологии МГМСУ

Динамика количества резистентных штаммов анаэробных бактерий (в %) к фторхинолонам

Чувствительность анаэробных штаммов к новым фторхинолонам за 2007 -2008 гг.

Кодирование резистентности к фторхинолонам • У фторхинолон-резистентных штаммов были выявлены мутации в соответствующих областях генома, кодирующих синтез ДНК-гираз (gyr. A, gyr. B гены, par. C и par. E). У резистентных изолятов (S. intermedius и P. gingivalis), в частности, отмечалось замещение аминокислотных остатков серина и лейцина, что, по-видимому, и определяло неспособность микробов к синтезу соответствующих ферментов. • Фторхинолон-резистентные изоляты обладали достаточно широким диапазоном MIC (в пределах от 2, 5 до 12, 5 mg/L). Сопоставление плазмидного профиля резистентных и чувствительных изолятов анаэробов не выявило достоверных ассоциаций с наличием плазмид qyn. A и qyn. B.

Эффективность химиотерапии в значительной степени зависит от генетической предрасположенности человека По данным литературы генетически обусловленные нарушения связаны с полиморфизмом генов, включая семейство генов IL-1.

Германия Контроль конъюгата [CC] Контроль специфичности [Spec-C] Контроль чувствительности IL-1 A-889 [Sens - IL-1 A] IL-1 A-C 889 - аллель 1[C] представлен в позиции – 889 IL-1 A гена. IL-1 A-889 T - аллель 2[Т] представлен в позиции – 889 IL-1 A гена. Контроль чувствительности IL-1 B+3953 [Sens - IL-1 B] IL-1 B+C 3953 - аллель 1[C] представлен в позиции +C 3953 IL-1 В гена. IL-1 B+3953 T - аллель 2[Т] представлен в позиции +C 3953 IL-1 В гена.

Отрицательный генотип После 40 лет после 60 лет

IL-1α и IL- β. Положительный генотип после 40 лет после 60 лет

Полиморфизм генов IL-1α и IL- β IL-1α IL- β относительная частота “положительного” генотипа в обследованной группе людей составила 46 % и только 10 % - у здоровых людей (Николаева Е. Н. )

выявлена ассоциация “положительного” генотипа с клиническими проявлениями агрессивной формы пародонтита у пациентов молодого возраста (до 35 лет) - 80 %, по сравнению с пациентами старше 50 лет - 30 %.

Вид анаэробных бактерий и вирусов Генотип человека Отношение частот р Положитель ный (n = 44) Отрицательный (n = 51) P. intermedia 29 (65, 6) 15 (29, 4) 2, 2 0, 0004 * B. forsythus 28 (63, 6) 20 (39, 2) 1, 6 0, 014* T. denticola 24 (54, 5) 14 (27, 5) 2, 0 0, 004* A. actinomycetemcomitans 17 (38, 6) 16 (31, 4) 1, 2 0, 341 P. gingivalis 33 (75, 0) 14 (27, 0) 2, 8 0, 0001* пять видов 7 (15, 9) 3 (5, 9) 2. 7 - нет микробов 3 (6, 8) 2 (3, 9) 1, 7 - HSV 1 типа 13 (29, 5) 4 (7, 8) 3, 8 0, 007* HSV 2 типа 3 (7, 3) 1 (2, 0) 3, 7 - CMV 6 (13, 6) 2 (3, 9) 3, 5 0, 089 EBV 12 (27, 2) 2 (3, 9) 6, 9 0, 0025*

Наилучший терапевтический эффект и эффект санации достигается при механическом удалении зубного налета и комплексной антимикробной терапии

Основные группы антибиотиков, эффективных в отношении вирулентной микробной флоры полости рта • тетрациклины (доксициклин, метациклин) • другие антибиотики широкого спектра действия, преимущественно для местного применения (левомицетин, грамицидин С). *** Аминогликозиды (гентамицин) противопоказаны за исключением микробиологически подтверждённых случаев инфекции, вызванной синегнойной и др. грамотрицательным палочками аэробной или факультативноаэробной группы, золотистым стафилококком или энтерококком Царёв В. Н. , Чувилкин В. И. , Трефилов А. Г. Стоматология для всех. – 2001.

Цефтриабол - цефалоспориновый антибиотик 3 поколения (цефтриаксон), производство Абол. Мед (Россия)

КЛЮЧ ДЛЯ НАЗНАЧЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ЛЕЧЕНИЯ Препарат Метронидазол (трихопол) Показания Системно: генерализованный пародонтит, ассоциированный с P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus, P. micros, T. denticola, Fusobacterium spp. , но не A. actinomycetemcomitans, Actinomyces Местно: локализованный пародонтит при положительной ПЦР на основные пародонтопатогены, но не A. actinomycetemcomitans, Actinomyces Дозировка Таблетки 400 мг: 3 раза в день в течение 5 -7 дней (при средней степ. тяжести) ли 10 -14 дней (при пародонтите тяжёлой степени) Плёнки «Диплен-Дента» с метронидазолом на дёсны на ночь в течение 10 -14 дн.

Линкомицин Клиндамицин (далацин ) Системно: генерализованный пародонтит, ассоциированный с P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus, P. micros, T. denticola, Fusobacterium spp. , но не A. actinomycetemcomitans, Actinomyces — « — Местно: локализованный пародонтит при положительной ПЦР на основные пародонтопатогены, но не A. actinomycetemcomitans, Actinomyces Капсулы (таблетки): 250 мг 3 раза в день в течение 7 дней (при средней степени тяжести) или 14 дней (при пародонтите тяжёлой степени) Плёнки «Диплен. Дента» с линкомицином на дёсны на ночь в течение 10 -14 дн.

Амоксициллин + Метронидазол Доксициклин Системно: генерализованные пародонтиты и выявление P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus, T. denticola, А. Actinomycetemcomitans, но не при внутриклеточной локализации. Амоксицилин: 3 х 500 мг/день Метронидазол: 3 х 400 мг/день Оба в течение 8 дней. Системно: генерализованные пародонтиты и выявление А. Actinomycetemcomitans, непереносимость пенициллина, включая внутриклеточные 1 -й день 1 х 200 мг 2 -й - 20 -й дни: 1 х 100 мг в день

Рокситромицин (Рулид) Системно: генерализованный пародонтит, в том числе, ассоциированный с A. actinomycetemcomitans, Actinomyces включая внутриклеточные 2 х 100 мг/день до 7 – 14 дней Ровамицин (Спирамицин) Системно: генерализованный пародонтит, в том числе, ассоциированный с A. actinomycetemcomitans, Actinomyces включая внутриклеточные Таблетки 300 млн. ЕД: 3 раза в день в течение 5 -7 дней (при средней степ. тяжести) или 10 -14 дней (при пародонтите тяжёлой степени)

Ровамицин (Спирамицин) Грамицидин С Местно: локализованный пародонтит при положительной ПЦР на основные пародонтопатогены, в том числе, A. actinomycetemcomitans, Actinomyces и внутриклеточные Местно: генерализованный или локализованный пародонтит при положительном тесте на пародонтопатогены, в том числе, при преобладании Fusobacterium spp. , S. Intermedius Плёнки «Диплен. Дента» с ровамицином на дёсны на ночь в течение 14 дней Защёчные таблетки 1500 ЕД: сосать 4 раза в день в течение 5 -7 дней или плёнки «Диплен-Дента» с грамицидином С на дёсны на ночь в течение 10 -14 дней

Моксифлоксацин (Авелокс) Системно: генерализованный пародонтит, в том числе, ассоциированный с таблетки 400 мг: принимать 1 раз в день в течение 5 -7 дней A. actinomycetemcomitans , A. ctinomyces и внутриклеточные Гемифлоксацин (Фактив) Системно: генерализованный пародонтит, в том числе, ассоциированный с A. actinomycetemcomitans , A. ctinomyces и внутриклеточные таблетки 320 мг: принимать 1 раз в день в течение 5 -7 дней

Антибиотики выбора для лечения хронических воспалительных процессов • Длительные курсы антибиотикотерапии (до 30 дней) при первичном выявлении хрон. процесса • Препараты сочетающие в себе антибактериальную активность и иммуномодулирующий эффект: - рокситромицин (рулид), спирамицин (ровамицин), кларитромицин (клацид) - цефтриаксон (цефтриабол), цефдизим (модивид) - грамицидин С (местно) • Комбинации бета-лактамных препаратов и иммуномодуляторов • П/анаэр. фторхинолоны 4 поколения: гати-, геми- и моксифлоксацин

Дозировка антибиотиков для однократного введения с целью периоперационной профилактики при некоторых видах хирургических вмешательств - Лоскутные операции и пластика при пародонтитах, дентальная имплантация, синуслифтинг, коррекция альвеолярного отростка, удаление ретенированных зубов, углубление преддверья полости рта Рокситромицин 150 мг за 40 -60 минут до операции ; Кларитромицин по 500 в/м или внутривенно, за 30 минут до операции ; Спирамицин 1, 5 млн. ЕД в/м или внутривенно за 30 минут до операции ; Моксифлоксацин 1, 0 мл в/м за 40 минут до операции; Клиндамицин 600 -900 мг в/в за 30 минут до операции; Линкомицин 0, 6 -1, 5 г за 30 минут до операции в/м; Цефазолин 1 -2 г. в/в за 30 минут до операции; Цефуроксим 750 мг за 30 минут до операции в/в или в/м. .

МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЛОСТИ РТА В. Н. Царёв, М. М. Давыдова УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ ДЛЯ СТУДЕНТОВ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ ФАКУЛЬТЕТОВ Москва - 2008

МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЛОСТИ РТА РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ – ПРАКТИКУМ Студента ___________ группы № _____ 3 курса стоматологического факультета МГМСУ Развитие гингивита и пародонтита связано с появлением на дёснах особых пародонтопатогенных бактерий: Porphyromonas gingivalis , Prevotella intermedia , Actinobacillus actinomycetemcommitans , Bacteroides forsythus , Treponema denticola , Eikenella corrodens , Wolinella и др. recta ikenella ЗАЩИТИТЬ ДЁСНЫ – ЗНАЧИТ ПРОДЛИТЬ ЖИЗНЬ Пародонтопатогенные бактерии, поддерживают длительное гнойное воспаление дёсен, вызывают общую интоксикацию организма, поражение иммунной и эндокринной систем, провоцируют развитие атеросклероза сосудов мозга и сердца, повышают риск развития инсульта и инфаркта миокарда. Для выявления пародонтопатогенных бактерий используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с набором «Мульти. Дент» . В последние годы получены новые данные о выявлении ДНК пародонтопатогенных бактерий из атеросклеротических бляшек сосудов и клапанов сердца. Все перечисленные бактерии вырабатывают токсины, которые приводят к длительному воспалению и разрушению тканей десны и альвеолярного отростка челюсти, гноетечению, кровоточивости, нарушению сосудистой микроциркуляции крови в тканях десен, дистрофическим изменениям, рассасыванию костной основы и выпадению зубов. Гигиенические мероприятия и обработка дёсен не избавляют пациента от носительства микробов, если в лечебный комплекс не включить антибактериальные препараты (антибиотики). РЕДАКЦИОННО-ИЗДАТЕЛЬСКИЙ ОТДЕЛ ГОУ ВПО МГМСУ РОСЗДРАВА МОСКВА - 2008

БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ !