Как образуется это разнообразие структур Общие принципы Предшественниками

Как образуется это разнообразие структур? Общие принципы. Предшественниками синтеза служат относительно небольшое количество первичных метаболитов. n Синтез четко спланирован и обслуживается набором специальных ферментов, причем некоторые из них весьма специфичны, а некоторые – нет n Для многих групп вторичных метаболитов существует несколько путей их синтеза. Часто этапы синтеза дублированы в разных компартментах клетки (например, пластиды – цитозоль). n

Биохимический моделист-конструктор. 1 этап Образуется «скелет» молекулы - "базовая" структура, на основе которой затем формируются многочисленные варианты. Принципы формирования «скелета» различны для разных групп вторичных метаболитов. n Для изопреноидов – формирование гибких цепочек разной длины - 10, 15, 20, 30, 40 атомов углерода (пренилтрансферазы), а затем сворачивание их в разнообразные циклы (циклазы). n Для алкалоидов – формирование гетероциклов за счет конденсации аминоальдегидов и/или аминокетонов, получаемых из аминов (аминооксидазы), которые в свою очередь формируются из аминокислот (декарбоксилазы)

Биохимический моделист-конструктор. 2 этап «Декорирование» скелета: метилирование, ацилирование, десатурация, гидроксилирование, гликозилирование. «Декорирование» может кардинально менять биологическую активность молекулы. У арабидопсиса в геноме: Найдено более 300 (!) генов различных изоформ цитохрома Р 450. Трансгенные растения арабидопсиса и табака с двумя чужеродными генами «цианогенных» цитохромов синтезировали цианогенные гликозиды. n Найдены гены более 100 диоксигеназ. Диоксигеназы участвуют в биосинтезе алкалоидов, флавонидов, гиббереллинов, этилена. Для них характерна широкая субстратная специфичность возможность использовать разные субстраты и образовывать несколько продуктов. n

Биохимический моделист-конструктор. 2 этап n Ацилтрансферазы. У арабидопсиса – более 50 генов. Ацилтрансферазы вторичного метаболизма у разных видов структурно близки и имеют консервативный гистидинсодержащий мотив. Структурно они также похожи на ацилтрансферазы первичного метаболизма. Гены ацилрансфераз в арабидопсисе собраны в кластеры на 5 хромосоме, тогда как гены диоксигеназ разбросаны по геному n Метилтрансферазы. O-, C-, N-и S- метилтрансферазы, метилируют флавониды, изопреноиды, алкалоиды, полиамины, поликетиды. C-, N-и S- метилтрансферазы эволюционно не связаны, О-метилтрансферазы представляют одну группу и имеют консервативный SАМ-связывающий мотив. n Гликозилтрансферазы. O-, C-, S- гликозилтрансферазы.

Образование алкалоидов. Общий взгляд

Образование пирролидиновых, пиперидиновых и пуриновых алкалоидов

Образование тропановых алкалоидов

Образование пирролизидиновых алкалоидов.

Образование акридоновых алкалоидов

Образование пуриновых алкалоидов.

Образование изохинолиновых алкалоидов. Формирование исходной структуры.

Образование изохинолиновых алкалоидов. Формирование «скелетов»

Образование изохинолиновых алкалоидов. Протоберберины.

Синтез изохинолиновых алкалоидов. Морфинаны

Образование сложных индольных алкалоидов. Исходная структура

Образование индольных алкалоидов. Формирование «скелетов» .

Ферменты синтеза алкалоидов. H 6 H, hyoscyamine 6β-hydroxylase; ODC, ornithine decarboxylase; PMT, putrescine-N -methyltransferase; TR-1, tropinone reductase 1 BBE, berberine bridge enzyme; CYP 80 B 1, ( S)Nmethylcoclaurine 3′-hydroxylase; TYDC, tyrosine decarboxylase.

Ферменты синтеза алкалоидов. AS, anthranilate synthase; CPR, cytochrome P 450 reductase; D 4 H, desacetoxyvindoline 4 -hydroxylase; DAT, acetyl-Co. A: 4 O-deacetylvindoline 4 -Oacetyltransferase; DXS, D-1 deoxyxylulose 5 phosphate synthase; G 10 H, geraniol 10 hydroxylase; SGD, strictosidine βD-glucosidase; SLS, secologanin synthase; STR, strictosidine synthase; TDC, tryptophan decarboxylase; T 16 H, tabersonine 16 -hydroxylase.

Два пути синтеза ИДФ в растениях: «классический» в цитозоле и «альтернативный» в пластидах.

Два пути синтеза изопентенилдифосфата в растениях: «классический» (MVA) в цитозоле и «альтернативный» (MEP) в пластидах.

Синтез изопреноидов. Формирование исходных структур ( «цепочек» )

Образование изопреноидов: формирование «скелетов»

В образовании вторичных метаболитов участвуют сотни ферментов Синтез изопреноидов: n 20 – 30 пренил-трансфераз n 100 – 200 циклаз n 200 – 300 «декорирующих» ферментов (оксигеназ, гидроксилаз, метил-, гликозил-, ацил-трансфераз)

Синтез фенольных соединений. Схема синтеза ароматических аминокислот

Синтез фенольных соединений. Шикиматный путь.

«Работа» глифосата связана с нарушением транспорта в хлоропласты ERSP-синтазы

Синтез фенольных соединений. Формирование фенилаланина и тирозина

Синтез фенольных соединений. Изозимы хоризмат-мутазы

Синтез фенилпропаноидов

Синтез фенилпропаноидов.

Начальные ферменты синтеза фенилпропаноидов Фенилаланин–аммиак-лиаза (ФАЛ, PAL). Первое сообщение – 1961 год (юбилей!), из ячменя, МВ ~ 330 k. Da, гомотетрамер, Опт. р. Н ~ 8, 8, без кофакторов. Структурно сходна с гистидин-аммиак-лиазой из Pseudomonas putida. Ряд изоформ. Как минимум две – ФАЛ 1 ингибируется кофейной и феруловой кислотами, ФАЛ 2 – бензойными кислотами. Кодируется мультигенным семейством. У Arabidopsis thaliana – 4 гена. Считается растворимым ферментом, однако известны цитоплазматическая и мембраносвязанные изоформы. Предполагается ее ассоциация с гидроксилазой коричной кислоты (С 4 Н), ассоциированной с ER. Активируется многими факторами (патогены, УФ). Для травянистых растений – распространена тирозин-аммиак лиаза (ТАЛ, TAL). Гидроксилаза коричной кислоты (С 4 Н, САН). Цитохром-Р 450 монооксигеназа. CYP 73 A 1. Известно более 80 цитохром-Р 450 семейства CYP 73 А 1, но не все имеют активность С 4 Н Мультигенное семейство, Два класса, существенно различающиеся по а-к последовательности, I – для однодольных, II – для двудольных. Гены клонированы, пробовали их экспрессировать в дрожжах… Кумарат-Со. А-лигаза (4 CL). Два класса, I и II. У арабидопсиса – 11 генов, но не все белки проявляют активность. Клонированы, экспрессированы в дрожжах…

Синтез фенольных соединений. Формирование лигнанов

Синтез фенольных соединений: пигменты cinnamate-4 hydroxylase (C 4 H), chalcone isomerase (CHI), chalcone reductase (CHR), chalcone synthase (CHS), 4 -coumaroyl: Co. Aligase (4 CL), dihydroflavonol 4 -reductase (DFR), 7, 29 -dihydroxy, 49 methoxyisoflavanol dehydratase (DMID), flavanone 3 hydroxylase (F 3 H), flavone synthase (FSI and FSII), flavonoid 39 hydroxylase (F 39 H)

Формирование флавоноидов

Синтез фенольных соединений. Формирование флавоноидов

Синтез фенольных соединений. Формирование изофлавоноидов

Образование беталаинов

Синтез цианогенных гликозидов

Образование цианогенных гликозидов

Образование глюкозинолатов

«Перекрест» образования глюкозинолатов и цианогенных гликозидов

Пример метаболической инженерии – вместо глюкозинолатов – амины…

Как появились ферменты вторичного метаболизма? Модель мембранной локализации 3 -гидрокси-3 метилглутарил-Ко. А-редуктазы ( HMGR). Белок содержит вариабельный гидрофобный N-концевой участок (синий), консервативные трансмембранные домены (оранжевые), вариабельные линкерные участки (зеленый и фиолетовый) и консервативный обращенный в цитозоль С-концевой каталитический домен (желтый). Изоформы HMGR, которые определяют синтез вторичных метаболитов после действия элиситоров (сесквитерпеноидных фитоалексинов) отличаются по N-концевому домену и гликозилированы в люмене ЭР.

Основные метаболические пути образования вторичных метаболитов. Часть I.

Основные метаболические пути образования вторичных метаболитов. Часть II.

Вторичные метаболизм – дорогое удовольствие…

Синтез и накопление вторичных метаболитов как правило, пространственно разделены Внутриклеточное разделение: n Синтез: цитозоль, ЭР, пластиды. n Накопление: вакуоль, периплазматическое пространство Флуоресценция стероидных гликозидов в клетке Dioscorea deltoidea in vitro

Внутриклеточная локализация синтеза и хранения вторичных метаболитов

Места хранения вторичных метаболитов

Вторичный метаболизм тонко скоординирован в пространстве и во времени и на уровне интактного растения. Синтез стероидных гликозидов происходит в листьях в водорастворимой (фуростаноловой) форме. Транспорт осуществляется по флоэме. Накопление происходит в эпидермальных тканях листьев и стеблей в фуростаноловой форме, в корневищах – в паренхиме в водонерастворимой спиростаноловой форме Фуростаноловый и спиростаноловые гликозиды отличаются наличием лишь одного остатка глюкозы, но кардинально - по биологической активности.

Аналогично – для хинолизидиновых алкалоидов

Локализация синтеза тропановых алкалоидов. PMT (путресцин-N-метил трансфераза) – экспрессия в перицикле корня красавки (A. belladonna) TR-1 (тропинон редуказа) – локализация в эндодерме и наружном кортексе корня белены (иммунологический анализ) H 6 H (гиосциамин -6βгидроксилаза) – в перицикле корня белены (иммунологический анализ) Синтез алкалоидов наблюдается только в кончиках молодых корней (1 – 3 см)

Локализация синтеза индольных алкалоидов Catharaynthus roseus TDC (триптофан декарбоксилаза) STR-1 (стриктозидин синтаза локализованы в клетках верхнего и нижнего эпидермиса листа. D 4 H (дезацетоксивиндолин – гидроксилаза DAT (деацетилвиндолин 4 -О-ацетилтрансфераза) – экспрессируются в идиобластах и млечниках листа. TDC и STR-1 также экспрессируются в в протодерме корня и кортикальных клетках корня вокруг апикальной меристемы. Синтез идет только в молодых листьях и корнях.

Локализация синтеза монотерпеновых индольных алкалоидов

Локализация синтеза индольных алкалоидов барвинка

Метаболизм растительной клетки - причудливое сочетание работы прокариотческих и эукариотических систем Синтез жирных кислот: согласованная работа многих органелл; две ацетил-Ко. А-карбоксилазы: • прокариотческого типа в пластидах, • эукариотического – в цитозоле. Синтез флавоноидов: Синтез изопреноидов ? ? параллельная работа шикиматного пути в пластидах и цитозоле

Два пути синтеза изопреноидов в растениях: «классический» (от архебактерий) в цитозоле и «альтернативный» (от эубактерий) в пластидах. Моно- сескви- и тритерпеноиды синтезируются по «классическому» пути в цитозоле клетки Моно- ди- и тетратерпеноиды - по «альтернативному» в пластидах Всегда ли?

Пластиды и вакуоли – важнейшие игроки в метаболическом «пасьянсе» Пластиды - «фабрика опасных и энергоемких производств» клетки: n Фотосинтез, n Восстановление нитритов и сульфатов, n Синтез всех жирных кислот, n Синтез аминокислот, пуринов, пиримидинов, Синтез вторичных метаболитов. n Вакуоли: n Место хранения многих метаболитов, в том числе вторичных (запасающие вакуоли), n Место разрушения метаболитов (литические вакуоли)

Тканевая локализация вторичных метаболитов А. Сканирующая электронная микрофотография поверхности листа тимьяна. Круглые структуры пельтатные железистые волоски (трихомы), в которых синтезируются моно- и сесквитерпены. B Световая микрофотография железистого волоска мяты, показанного в продольном сечении. C – субкутикулярное пространство; S, секреторные клетки; St - ножка; B, базальная клетка; E, эпидермальная клетка. C. Световая микрофотография секреторной полости в листе лимона, показанной в поперечном сечении. L, люмен; Sh, клетки футляра; P, клетки паренхимы. D. Световая микрофотография смоляного хода в древесине сосны Джеффра, показанной в поперечном сечении X, вторичная ксилема.

Трихомы и железы листа стевии

Ультраструктура клеток железки листа стевии

Летучие вторичные метаболиты львиного зева и петунии * * OCH 3 Интенсивность (E)- -ocimene * methylbenzoate * * OH O CH 3 nerolidol O CH 3 myrcene OH * OCH 3 methylbenzoate O * H * benzaldehyde O dimethoxytoluene linalool Интенсивность O O H CH 2 O O OCH 3 OH benzylbenzoate isoeugenol phenylacetaldehyde IS 8 10 12 14 16 18 20 Время выхода (min) Изопреноиды 22 24 26 5 * 10 Время выхода (min) Фенилпропаноиды и бензоиды

Возможные пути биосинтеза летучих бензоидов и фенилпропаноидов в цветках петунии 120 Methylbenzoate Relative Ion Intensity 80 40 0 120 NH 2 * 2 H * PAL 5* * * 2 H -Phe 5 2 H 3 55 75 95 115 155 195 m/z d 5 -labeled 80 40 0 COOH unlabeled 55 75 95 115 155 195 m/z

Пути синтеза бензоидов в цветках петунии ночью и днем Свет толщина линии отражает интенсивность потока Темнота нет потока очень слабый поток Синтез бензойной кислоты из бензилбензоата является светозависимым процессом. Orlova et al. (2006) Plant Cell 18

Ночью и днем в цветках петунии активизируются различные пути биосинтеза бензоидов Свет толщина линии отражает интенсивность потока Темнота нет потока очень слабый поток В темноте основной вклад в формирование бензоидов вносит путь синтеза, начинающийся не из фенилаланина… Orlova et al. (2006) Plant Cell 18

Что сделали в Японии (группа F. Sato) в качестве исходного субстрата использовали дофамин, а в E. coli ввели гены моноамин оксидазы (MAO), норкоклуарин синтазы (NCS), норкоклаурин 6 -O-метилтрансферазы (6 OMT), коклаурин--N-метилтрансферазы (CNMT) и 3’-гидрокси-N-метилкоклаурин-4’-Oметилтрансферазы (4’OMT). В результате в клетках E. coli был получен синтез коклаурина. Важно, что в экспериментах были использованы гены двух изоформ NCS, но только одна из них показала высокий уровень экспрессии в E. coli.

А затем – уже в дрожжи ввели ген недавно идентифицированной цитохром-Р 450 -оксидазы (CYP 80 G 2, коритуберин-синтаза) вместе с генами CNMT и берберинформирующего энзима (BBE) из Coptis japonica. Трансгенные дрожжи выращивали на среде, содержащей коклаурин, экскретируемый трансгенными клетками E. coli. Показали, что клетки дрожжей содержат магнифлорин и скоулерин. Конечная продуктивность – 55 мг/л (S)-ретикулина, 7, 2 мг/л магнифлорина и 8, 3 мг/л скоулерина.

И, наконец… Дополнительная экспрессия в дрожжах генов трех ферментов (NCS, 6 OMT, CNMT) из Thalictrum flavum, Papaver somniferum и A. thaliana привела к синтезу (S)-скоулерина, (S)-тетрагидроколумбамина и (S)тетрагидроберберина из (S)-ретикулина. Любопытно, что экспрессия человеческой цитохром-Р 450 -оксидазы вместе с соответствующей редуктазой привела к формированию из ретикулина салютаридина, показав новую активность введенного фермента…

Паклитаксел в дрожжах? Пять генов начальных этапов биосинтеза паклитаксела (до образования таксадиен-5 ацетокси-10 -ола) были введены в Saccharomyces cerevisiae. Было показано, что ферменты, кодируемые гетерологичными генами, с успехом используют предшественники синтеза изопреноидов дрожжей. Это привело к образованию в клетках дрожжей таксадиена (1 мг/л) и таксадиен-5 -ола (более 25 мкг/л). Однако биосинтез прерывался на стадии гидроксилирования, осуществляющегося цитохром. Р 450 -оксидазой THY 10 b…

Артемизинин в дрожжах… В Saccharomyces cerevisiae осуществили экспрессию трех генов - аморфадиен синтазы, аморфадиен-оксидазы и цитохром Р 450 -редуктазы биосинтез от фарнезилдифосфата до артемизиновой кислоты. Получили артемизиновую кислоту более 100 мг/л.

Пока единственный пример полного синтеза растительного вторичного метаболита в бактерии… В E. coli ввели «сборную солянку» генов – Фенилаланин-аммаик лиазу (PAL) из Rhodotorula rubra 4 -Кумарил-Kо. А-лигазу 4 CL из S. coelicor Халконсинтазу CHS из Glycyrrhiza echinata Халконизомеразу CHI из Pueraria lobata Флавоноидов получили мало, но получили. Однако после оптимизации и всяческих доработок - 700 mg/л флавононов 113 mg/л антоцианинов…

Зачем нужен вторичный метаболизм растению? Основные точки зрения: n n Совсем не нужен (вторичные метаболиты – «отходы производства» ) Вторичные метаболиты – запасные соединения Вторичные метаболиты – защитные соединения Вторичные метаболиты – «биохимические инструменты» взаимодействия растения с окружающей средой Но как это доказать ?

Стратегия защиты растения от патогенов. Три круга обороны. Проще всего доказать защитную роль вторичных метаболитов, участвующих в работе третьего круга обороны: фитоалексины

летучие терпеноиды системный ответ К КС ФА вакуоль ПАТОГЕН СК системин РИБ дефензины м. РНК ферменты фенилпропаноидного метаболизма ферменты терпеноидного метаболизма нуклеазы хитиназа, -1, 3 глюаназа каллоза ингибиторы гликаназ, протеиназ каллозосинтаза пролилгидроксилаза апоптоз цистеиновые протеиназы пероксидазы ОПБ укрепление КС К

Фитоалексины – индуцибельные вторичные метаболиты

А как доказать функции не индуцибельных вторичных метаболитов? Примеры защитных соединений «первого круга» обороны. Авенацин А 1 присутствует только в корнях овса, его нет у пшеницы и ячменя. Мощная защита от патогенного гриба Gaeumannomyces graminis var. tritici, который поражает пшеницу и ячмень, но никогда – овес. У гриба Gaeumannomyces graminis var. avenae есть фермент авенациназа, который удаляет концевые глюкозы и делает молекулу нетоксичной и этот гриб прекрасно «кушает» овес…

Примеры защитных соединений «первого круга» обороны: алкалоиды

Примеры защитных соединений «первого круга» обороны: изопреноиды • инсектициды: α- и β-пинены, мирцен, камфен, пиретрин-1 • аллелопатические свойства: лимонен, цинеол, карвон, камфора • реппеленты: ментол, непаталактон. α-пинен • против травоядных: 1, 8 -цинеол Но – линалоол – привлечение опылителей… Механическое повреждение – в смоле пихты изменяется содержание пинена, каурена, мирцена. У устойчивых к абиотическому стрессу растений (загрязнение атмосферы) – много камфена и лимонена, но мало β-пинена, у неустойчивых – наоборот. После стресса (обработка SO 2) – в 5 – 10 раз повышается содержание камфена, α- и β-пинена.

Эфирные масла с антимикробиальной активностью

Эфирные масла с антимикробиальной активностью против Helicobacter

Эфирные масла чайного дерева

Алкалоиды с антимикробиальной активностью против Helicobacter

Антивирусная активность эфирных масел Plant source Viruses IC 50 (%; ppm) References Herpes simplex virus ( HSV; DNA virus) Aloysia gratissima HSV-1 65 ppm Garcia et al. (2003) Artemisia douglasiana HSV-1 83 ppm Garcia et al. (2003) Citrus limon HSV-1 0. 0015% Koch (2005) Eucalyptus globulus HSV-1 0. 009% Schnitzler et al. (2001) HSV-2 0. 008% Schnitzler et al. (2001) Eupatorium patens HSV-1 125 ppm Garcia et al. (2003) Houttuynia cordata HSV-1 0. 0013% Hayashi et al. (1995) Hyssopus officinalis HSV-1 0. 0001% Koch (2005) HSV-2 0. 0006% Koch (2005) Illicium verum HSV-1 0. 004% Koch (2005) HSV-. 2 0. 003% Koch (2005) Leptospermum HSV-1 0. 0001% Reichling et al. (2005 scoparium HSV-2 0. 00006% Reichling et al. (2005 Matricaria HSV-1 0. 00003% Koch (2005) recutita HSV-2 0. 00015% Koch (2005) Melaleuca alternifolia HSV-1 0. 0009% Schnitzler et al. (2001) HSV-2 0. 0008% Schnitzler et al. (2001) Mentha piperita HSV-1 0. 002% Schuhmacher et al. (2003) HSV-2 0. 0008% Schuhmacher et al. (2003) Pinus mugo HSV-1 0. 0007% Koch (2005) HSV-2 0. 0007% Koch (2005) Santalum album HSV-1 0. 0002% Koch (2005) HSV-2 0. 0005% Koch (2005) Tessaria absinthioides HSV-1 105 ppm Garcia et al. (2003) Thymus vulgaris HSV-1 0. 001% Koch (2005) HSV-2 0. 0007% Koch (2005) Zingiber officinale HSV-1 0. 0002% Koch (2005) HSV-2 0. 0001% Koch (2005)

Примеры защитных соединений «первого круга» обороны: изопреноиды Сесквитерпеноиды: селинен – инсектицид Е-β-фарнезен (паслен) – ферромон тревоги насекомых Дитерпены: кауреновая и трахилбановая кислоты (цветки подсолнечника) – гибель личинок бабочек Паклитаксел (тис) – яд для животных Тритерпеноиды: сердечные гликозиды - яд для животных Экдистероиды – нарушение развития насекомых.

Защитное действие смол. Массовая атака короедов сосны на ствол Pinus contorta. Каждое белое пятно на стволе - место нападения жуков и выделения смолы из поврежденного ими участка. Дерево пережило атаку жуков, так как содержание токсичных компонентов эфирного масла, содержащихся в смоле, было достаточно, чтобы убить короедов, которые были затем “удалены” оттоком смолы. После испарения эфирных масел и воздействия воздуха, дитерпеновые смоляные кислоты затвердевают и формируют «пробку» , которая «запечатывает» рану.

Примеры защитных соединений «второго круга» обороны: цаногенные гликозиды, глюкозинолаты.

Примеры защитных соединений «второго круга» обороны: кумарины, фурокумарины Антимикробное, фунгицидное действие. Наркотическое действие – на земляных червей и кроликов Гипнотическое действие – на мышей. Кумарины с аминоалкильным заместителями – стимулируют ЦНС. Псорален, бергаптен – яды для рыб. Псрален – аллелопатическое действие. Южные широты – в качестве заместителей – изопреноиды. Средние широты – кумарины, обогащенные кислородом. Северные широты – гликозиды, сложные эфиры, метокси-группы. Псорален – фотосенсибилизатор. 270 и 360 нм. 5 мг на кожу – УФ лампа – через 5 минут сильный ожог. Граница распространения – между 45 и 55 о с. ш. Севернее – он не встречается. К югу – число видов с псораленом увеличивается.

Но: постоянное присутствие и биологическая активность не являются достаточным доказательством. Что делать? Один из возможных подходов – использование культур клеток высших растений

Но: постоянное присутствие и биологическая активность не являются достаточным доказательством. Что делать? Один из возможных подходов – использование культур клеток высших растений Основные свойства культуры клеток высших растений экспериментально созданной популяции соматических клеток Снятие организменного контроля развития переход к популяционным механизмам развития системы n Отбор клеток по максимальной и/или устойчивой пролиферации основной принцип развития поуляции n гетерогенность системы по различным признакам основа адаптационных возможностей системы n Узкие адаптационые возможности системы следствие отсутствия длительной эволюции Большой невостребованный генетический материал – клетки in vitro имеют полную информацию об интактном растении n Влияние невостребованных генов на развитие популяции n Судьба невостребованного генетического материала – возникновение и скорость мутаций, сомаклональных вариаций n Включение/выключение невостребованных блоков – программы морфогенеза, соматического эмбриогенеза

Клетки высших растений in vitro - слабовакуолизированные пролиферирующие клетки с небольшим количестовм пластид

Некоторые закономерности синтеза вторичных метаболитов в культуре клеток высших растений n Избирательная возможность синтеза метаболитов не получен синтез морфинанов, димерных индольных алкалоидов, карденолидов. n Различия в синтезе по классам соединений добиться синтеза фенольных соединений и изопреноидов проще, чем алкалоидов n Различная стабильность синтеза для разных соединений при длительном субкультивирвоании. Стабильный синтез соединений, способствующих пролиферации клеток. n Различные закономерности синтеза в цикле культивирования. Часто синтез активируется при замедлении роста культуры, реже – во время активной пролиферации клеток.

Клетки высших растений in vitro - гетерогенная популяция соматических клеток Морфологическая - клетки табака в суспензии Генетическая - различное число хромосом в клетках женьшеня Биохимическая - флуоресценция клеток диоскореи в культуре перестройки хромосом в клетках пшеницы

Вторичный метаболизм в клетках in vitro - синтез изопреноидов n Dioscirea deltoidea ginseng, P. japonicus, P. quinquefolius стероидные гликозиды n Panax тритерпновые гликозиды (гинзенозиды) n Serratula экдистероиды n Stevia дитерпеновые гликозиды (стевиол-гликозиды) coronata, Ajuga reptans rebaudiana n Polyscias filicifolia гликозиды тритерпеновые

Синтез фуростаноловых гликозидов в культуре клеток Dioscorea deltoidea Протодиосцин В клетках диоскореи синтезируются стероидные гликозиды, характерные как для листьев (протодиосцин), так и для корневища (дельтозид) интактного растения. Кроме того появляются 26 -Sизомеры, не характерные для интакнтого растения. S-

Экдистероиды Serratula coronata HO HO OH OH HO HO HO НО OH H O 20 -гидроксиэкдизон HO H CH 2 OH НО OH OH 25 S- инокостерон OH OH OH НО H O НО Макистерон А OH HO Экдизон

Экдистероиды Ajuga reptans С 27 - стероиды HO OH HО OH OH OH HO HО OH HO HO C 28 - стероиды 20 - гидроксиэкдизон HО OH Полиподин В HО O О HО OH О О О HО HО OH HО НО O C 29 - стероиды 29 - норциастерон HO OH HО НO 29 - норсенгостерон O OH HО OH HO O O О OH HO HО HO OH HO HO Аюгастерон В O HO Аюгалактон HО OH НО O Сенгостерон

ВЭЖХ хроматограммы экдистероидов интактного растения и культур клеток серпухи Serratula coronata Состав экдистероидов длительно культивируемого каллуса приближается к составу этих соединений в листьях растения OH HO HO 20 -гидроксиэкдизон а - листья интактного растения б - длительно культивируемая каллусная культура в - молодая каллусная культура, 1 - 20 -гидроксиэкдизон; 2 - инокостерон; 3 - макистерон А; 5 - экдизон;

Хроматограммы ВЭЖХ экдистероидов интактного растения и клеточных культур Ajuga reptans OH HO HO 20 -гидроксиэкдизон а - листья интактного растения б - длительно культивируемая каллусная культура в - молодая каллусная культура, 1 - полиподин В; 2 - 20 -гидроксиэкдизон; 3 - 29 -норциастерон; 4 - 29 -норсенгостерон; 5 - сенгостерон; 6 - аюгалактон; 7 - аюгастерон В;

Женьшень и структура гинзенозидов - тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда

Cструктура семи основных гинзенозидов Гинзенозиды Rg-группы Гинзенозиды Rb-группы

Содержание гинзенозидов в культуре клеток Panax ginseng в трех последовательных субкультивированиях на двух разных средах % Среда ТО % Среда 62

Содержание гинзенозидов в цикле выращивания суспензионной культуры клеток Panax japonicus (repens) Общее содержание гинзенозидов Соотношение Rg/Rb групп

Структура стевиол-гликозидов - тетрациклических дитерпеновых гликозидов стевии Стевиозид = R 1: Glu R 2: Glu- Glu Ребаудиозид А = R 1: Glu R 2: Glu- Glu | Glu Ребаудиозид С = R 1: Glu R 2: Glu- Rha | Glu

Содержание стевиол-гликозидов в интактных растениях Stevia rebaudiana и культурах in vitro (mg/g) 1. Intact plant 2. Plant in vitro 3. “Roller” plant 1. Callus culture 2. Suspension culture 3. Morphogenic callus 4. Shoots from morphogenic callus

Содержание стевиол-гликозидов в миксотрофных каллусных культурах стевии

Ультраструктура клеток каллусных культур стевии Миксотрофная каллусная культура n Гетеротрофная каллусная культура

Вторичный метаболизм – лужок с еще не выщипанной травкой…