
Воздушно-капельные инфекции (часть 2).ppt
- Количество слайдов: 97
Кафедра микробиологии и вирусологии РГМУ им. Р. И. Пирогова БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ВОЗДУШНО-КАПЕЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ
Лабораторная диагностика туберкулеза, дифтерии, легионеллеза
Туберкулез • Это хроническая бактериальная инфекция с образованием гранулем в пораженных тканях и выраженной реакцией клеточного иммунитета с участием цитотоксических Тлимфоцитов (гиперчувствительность замедленного типа, ГЗТ)
Микобактерии • Отдел Firmicutes • Сем. Mycobacteriaceae • Род Mycobacterium Патогенные для человека возбудители – Мусоbacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. leprae Условно-патогенные(атипичные) микобактерии M. kansasii M. intracellulare M. scrofuloceum
Микобактерии туберкулеза
Микобактерии – возбудители туберкулеза легких • Неподвижные, тонкие прямые или несколько изогнутые палочки • Клеточная стенка представлена большим количеством липидов (40%) Высокое содержание липидов обеспечивает устойчивость к кислотам, спиртам, щелочам, дезинфицирующим средствам • Это факультативные внутриклеточные паразиты
Факторы патогенности • Липидные фракции клеточной стенки • Корд-фактор (димиколат трегалозы) – фактор адгезии и колонизации, антифагоцитарный фактор • Воск Д – пептидогликолипид, содержит миколовые кислоты, антифагоцитарный фактор • Белковый фактор - Туберкулин (высвобождается при распаде микобактерий) – антиген, против которого направлен иммунный ответ
Роль корд-фактора и миколиновых кислот в патогенезе туберкулеза • Подавляют слияние фаго- и лизосомы, • Усиливают секрецию макрофагами провоспалительных цитокинов (IL-1, TNFα), • Служат адъювантами, усиливая и ускоряя процессы активации и дифференцировки клонов цитотоксических. Т-клеток
Структура микобактерий
Строение клеточной стенки M. tuberculosis миколовая к-та(2), арабиногалактан (3), пептидогликан (4), цитоплазматическая мембрана (5)
1 этап микробиологической диагностики- преаналитический • Взятие мокроты • Исследуют утреннюю порцию свободно откашливаемой мокроты, натощак. Перед откашливанием необходимо почистить зубы, десны, язык, слизистую щек и прополоскать рот кипяченой водой • Мокроту собирают в стерильный контейнер с завинчивающейся крышкой. Сроки доставки в лабораторию – не более 1, 5 -2 часов от момента ее получения
Бактериоскопический способ микробиологической диагностики • Бактериоскопический метод включает: • - прямую микроскопию • - микроскопию предварительно обогащенного материала • - люминисцентную микроскопию
Прямая микроскопия клинического материала Прямая микроскопия: пробу собранной мокроты растирают между предметными стеклами, готовят мазки и окрашивают их по методу Циля. Нильсена • На голубом фоне мокроты видны рубиново-красные кислотоустойчивые микобактерии
Бактериоскопический метод (продолжение) • Микроскопия предварительно обогащенного материала: мокроту концентрируют с помощью методов гомогенизации и флотации -гомогенизация: к собранной в течение суток мокроте добавляют 1% р-р Na. OH, встряхивают (шюттель – аппарат) и центрифугируют - флотация: гомогенизированную мокроту помещают в колбу с узким тубусом, добавляют ксилол или бензол, встряхивают и доливают дистиллированную воду до метки (50 или 100 мл), • всплывают капли ксилола и сорбированные на них микобактерии. Готовят мазки и окрашивают их по Цилю-Нильсену
Метод флотации (окраска мазка по Цилю-Нильсену)
Микобактерии туберкулеза (мазки после методов гомогенизации и флотации, окраска по Граму)
Бактериоскопический метод диагностики Люминисцентная микроскопия • Основана на свойствах липидов микобактерий поглощать люминисцентные красители и создавать свечение в люминисцентном микроскопе • Мазки окрашивают (ауромин+родамин) • Туберкулезные микобактерии дают желто-зеленое свечение, нетуберкулезные – зеленое
Микрокультивирование (метод Прайса) • Метод ускоренной диагностики, сочетание бактериологического метода (микрокультивирования) и микроскопии • Готовят мазки с предварительной обработкой мокроты 2%-ным р-ром H 2 SO 4 (чтобы убрать сопутствующую микрофлору) и помещают стекла в цитратную кровь (жидкая питательная среда) • Через каждые 3 -5 дней проводят анализ окрашенных мазков для выявления микроколоний микобактерий • Вирулентные палочки туберкулеза обнаруживают по присутствию корд-фактора в виде изогнутых жгутов, невирулентные микобактерии - по рыхлым скоплениям бактериальных клеток
Корд-фактор микобактерий туберкулеза
Корд-фактор (окраска родамин + аурамин)
Бактериологическое исследование Цель – получить чистую культуру возбудителя туберкулеза, идентифицировать бактерии и определить чувствительность к терапевтическим препаратам Мокроту обрабатывают щелочью (2%р-р Na. OH) или кислотой (10% р-р H 2 SO 4), затем делают посев полученного осадка на яичную среду Левенштейна Йенсена (или другие среды: Финна-II, Сотона) и длительно инкубируют (например, до 2 мес) • M. tuberculosis образуют «морщинистые» колонии кремового цвета (R-форма) При дифференциальной диагностике проводят ниациновую пробу (способность микобактерий туберкулеза синтезировать никотиновую кислоту
M. Tuberculosis (среда Левенштейна-Йенсена)
Культуральный метод (среда Левенштейна-Йенсена)
Колонии M. tuberculosis
Серологический метод • Выявляют антитела в сыворотках больных • Идентифицируют антигены микобактерий в исследуемом клиническом материале • В реакциях используют методы: РСК, РПГА, ИФА
Идентификация возбудителя • При диагностике туберкулеза используют молекулярно-генетический метод • Разработаны «чипы» , что позволяет четко установить структуру микобактерий туберкулеза
Диагностика туберкулеза кожно-аллергическая проба • Туберкулиновая проба – результат зависит от риска заражения и прогрессирования процесса
Туберкулиновая проба • Проба Манту – внутрикожная проба – применяется как основной метод диагностики при массовых обследованиях населения • Проба предназначена для отбора группы лиц с целью ревакцинации, раннего выявления начальных форм туберкулеза, обнаружения случаев инфицирования микобактериями • Туберкулин – комплекс факторов, которые высвобождаются при распаде микобактерий • Состоит из белковых фракций и содержит полисахариды. Это основной антиген, который вызывает иммунный ответ в сенсибилизированном организме, обусловленный активностью цитотоксических Т-лимфоцитов
Проба Манту Применяемые препараты • Туберкулин – комплекс факторов, которые высвобождаются при распаде микобактерий • Состоит из белковых фракций и содержит полисахариды. Это основной антиген, который вызывает иммунный ответ в сенсибилизированном организме, обусловленный активностью цитотоксических Т-лимфоцитов • PPD выбран в качестве Международного стандарта это очищенный препарат, производный микобактерий туберкулеза (широко применяется в настоящее время)
Результат положительной пробы Манту – реакция гиперчувствительности замедленного типа, ГЗТ • Белок туберкулин, впервые выделенный после культивирования в глицериновой питательной среде, был способен вызывать через 24 -48 ч характерную реакцию после внутрикожного введения инфицированным пациентам. Это ГЗТ реакция гиперчувствительности замедленного типа • При ГЗТ сенсибилизированные Т-клетки инфицированного пациента концентрируются в месте введения туберкулина. Через 72 ч – учет результатов реакции Положительная проба: папула d= 5 мм и более Отрицательная проба: уколочная реакция (0 -1 мм) указание на отсутствие предшествующей инфекции
Механизмы патогенеза • Макрофаги могут стать «убежищем» для внутриклеточных патогенов • При отсутствии элиминации возбудителя – туберкулезная палочка остается в фагосоме • Персистенция внутриклеточных патогенов в альвеолярных макрофагах, а также активация макрофагов и Т-лимфоцитов в инфицированной ткани могут привести к образованию гранулемы
Макрофаги Распознавание микобактерий и участие в противоинфекционном иммунитете (синтез NO и IL-12)
Состав гранулемы • Ядро – макрофаги, многоядерные гигантские клетки (от слияния активированных макрофагов), эпителиальные клетки • Периферия – скопление Т-лимфоцитов • Композиция гранулемы включает также нейтрофилы, дендритные клетки, компоненты внеклеточного матрикса, такие как коллаген
Механизмы патогенеза • Центр гранулемы подвергается казеозному некрозу. В процесс вовлекаются молекулы адгезии, хемокины и цитокины (медиаторы иммунного ответа). • Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ CD 8+) • способны осуществлять киллинг инфицированных макрофагов, которые становятся мишенями для ЦТЛ, если не отвечают на активацию и не способны к деструкции бактерий, • секретируют IFN обеспечивая путь для дополнительной активации макрофагов и развития защитного иммунитета
формирование гранулемы
Первичная инфекция M. tuberculosis
Патогенез туберкулеза легких
Туберкулез Первичная инфекция
Патогенез • Первичный туберкулез характеризуется формированием воспалительного очага на фоне развития ГЗТ • При кальцинировании области поражения остается очаг Гона (формируется в ткани легких и регионарных лимфатических узлах • Вторичный туберкулез • может развиться спустя годы у лиц зрелого и пожилого возраста
Механизмы патогенеза • Казеозный некроз и фиброз рассматривают как результат действия цитокинов • Микобактерии поглощаются альвеолярными макрофагами, которые активируются и продуцируют IL-I, IL-8. TNF • Некроз ткани может быть связан с выходом TNFα в кровь
Вакцинация Вакцина - БЦЖ — Бацилла Кальметта— • Герена (Bacille Calmette—Guérin, BCG) — приготовлена из Mycobacterium bovis непатогенного штамма С 2006 года некоторые страны прекратили массовую вакцинацию В России вакцинируют на 3 -7 день жизни ребенка, в 7 и 14 лет.
Лечение туберкулеза рифабутин или стрептомицин или рифампицин канамицин изониазид или фтивазид пиразинамид или этионамид
Дифтерия – это острое инфекционное заболевание Характеризуется: • фибринозным воспалением верхних дыхательных путей и • токсическим поражением сердечнососудистой, нервной и других систем органов
C. diphtheriae – возбудитель дифтерии Род Corynebacterium Вид C. diphtheriae, токсигенный штамм • Коринебактерии объединяют в особую группу без указания семейства • Наряду с дифтерийной палочкой в организме человека могут присутствовать условно-патогенные коринебактерии C. pseudodiphtheriticum, C. xerosis, С. ulcerans
Corynebacterium diphtheriae • Грамположительные • палочки с булавовидными утолщениями на концах (зерна волютина, тельца Бабеша-Эрнста) • аэробы и факультативные анаэробы • Размеры: ширина 0. 6 -0. -0, 8 μ m, длина 3 -6 µm • Неспорообразующие • Окраска по Нейссеру или Леффлеру - для демонстрации гранул
Токсигенность C. diphtheriae Токсигенность возбудителя дифтерии обусловлена инфицированием умеренными бактериофагами • Бактериофаг вносит в бактериальную клетку tox- ген, который индуцирует продукцию дифтерийного токсина • Штаммы, не инфицированные такими бактериофагами, или утратившие лизогенность, не продуцируют токин и не вызывают дифтерию •
Микробиологическая диагностика дифтерии • Преаналитический этап –получение клинического материала (сухим тампоном, пленки отделяют пинцетом) • Исследуют пленки или слизь из зева, носа и других участков поражения • Бактериологическое исследование следует начинать не позднее чем через 3 ч после взятия материала
Бактериоскопический метод • Исследуют микропрепараты, окрашенные по Граму, Леффлеру, Нейссеру • На мазках обнаруживают палочки с морфологией и расположением, характерным для C. diphtheriae (зерна волютина на полюсах клеток)
C. diphtheriae (окраска по Граму)
C. diphtheriae (окраска по Леффлеру)
C. diphtheriae (окраска по Нейссеру)
Бактериологическое исследование • Делают посев клинического материала на среду Клауберга: кровяной агар с теллуритом калия (этот реагент включают в среду для подавления роста грамотрицательной микрофлоры) • На следующем этапе проводят анализ колоний с учетом 3 -х биоваров • C. diphtheriae gravis, mitis, intermidius
C. diphtheriae gravis образует крупные колонии с зубчатыми краями и серые колонии (без β-гемолизинов)
C. diphtheriae mitis образует крупные, круглые, m выпуклые и черные колонии, которые являются β-гемолитическими
Колонии C. diphtheriae биовар mitis
Колонии C. diphtheriae gravis mitis
Колонии С. diphtheriae биовар intermedius • Образует мелкие, выпуклые, серые колонии ( требуют для роста добавление сыворотки)
Бактериологический метод • На следующем этапе бактериологического исследования делают пересев с колоний на скошенный агар: сывороточный агар или свернутую сыворотку
Идентификация C. diphtheriae Биохимическое типирование: Выделенная культура ферментирует глюкозу, галактозу, цистеин. Не расщепляет сахарозу и мочевину • Определение токсигенности - Используют метод Оухтерлони - двойной диффузии в геле: на поверхность агара помещают стерильную полоску фильтровальной бумаги, смоченную стандартной антитоксической противодифтерийной сывороткой • По обеим сторонам полоски симметрично наносят исследуемый материал. В случае токсигенности, при встречной диффузии выпадает полоса преципитата
Метод двойной диффузии в геле (реакция преципитации в агаре по Оухтерлони)
Определение токсигенности • Токсигенность выделенных культур C. diphtheriae определяют также при помощи РПГА, РОНГА – тестов, которые отличаются высокой чувствительностью • (результат получают в день исследования, нередко через 2 ч)
Результаты анализа при подозрении на дифтерию • Предварительный ответ из лаборатории – через 24 ч: «Обнаружены палочки дифтерии» • Окончательный ответ – через 48 ч после анализа на токсигенность: «Выявлен возбудитель дифтерии – C. diphtheriae, токсигенный штамм» -
Факторы патогенности C. diphtheriae • • • Факторы адгезии и колонизации: вероятно, эта роль принадлежит компонентам клеточной стенки и микрокапсуле Антифагоцитарный фактор – корд-фактор (димиколат трегалозы): нарушает процессы дыхания в митохондриях фагоцитов Ферменты инвазии- гиалуронидаза, нейраминидаза Токсический фактор – гемолизин Дифтерийный токсин – гистотоксин – основной фактор патогенности (механизм действия – блокада синтеза белка)
Механизм действия дифтерийного токсина • Токсин (А-фрагмент) проникает в клетку путем эндоцитоза. Его активация происходит в процессе протеолитического расщепления и редукции дисульфидных мостиков. • Токсин служит катализатором переноса аденозин-дифосфат-группы ADP с коэнзима NAD на белок-мишень (фактор элонгации-2). EF-2 – это фактор синтеза белка эукариот. Основной механизм действия экзотоксина – блокада синтеза белка
Механизм действия дифтерийного токсина
Фракции дифтерийного токсина Выделяют 4 фракции токсина: • Гистотоксин • «Истинный токсин» , структурно подобный ферменту дыхания цитохрому b • Гиалуронидаза • Гемолизин
Патогенез дифтерии • Входные ворота –область ротоглотки, иногда гортань, глаза, половые органы (у девочек), • раны (раневая дифтерия новорожденных в форме поражения пупочной области – грануляция пупочного кольца (покрывается серовато-желтоватым налетом)
– Гистотоксин (Некротоксин) – под его действием развивается некроз поверхностного эпителия, повышается проницаемость сосудов, что приводит к выходу плазмы в окружающую ткань. – Фибриноген плазмы при участии тромбопластина некротизированного эпителия переходит в фибрин, который выпадает в виде фибринозной пленки; пленка связана с подлежащей тканью, развивается воспаление и отек.
• Истинный токсин частично структурно подобен ферменту дыхания цитохрому b, замещает его и блокирует дыхание. • Гиалуронидаза воздействует на соединительную ткань, что приводит к повышению проницаемости сосудов • Гемолитический фактор приводит к появлению геморрагических явлений. • Инфекционно-токсический шок – основное осложнение при дифтерии
Патогенез дифтерии
Клинические формы
Клинические осложнения • Дифтерия глаз сопровождается отеком век, обильным гнойным отделяемым. При тяжелой форме появляются плотные налеты не только на конъюнктиве век, но и на конъюнктиве глазного яблока. Последствия –язвенный кератит, возможна потеря зрения. • Поражение сердца –токсический миокардит: в кардиомиоцитах развиваются явления миокардиодистрофии с последующим некрозом. • Поражение капилляров сопровождается инфекционно-токсическим шоком. • Поражение нервных клеток сопровождается демиелинизацией нервных волокон.
Кожные поражения при дифтерии
Дифтерия отек, поражение дыхательных путей
Клинические манифестации при дифтерии
Особенности иммунитета при дифтерии • Для оценки антитоксического иммунитета используют серологический метод • После перенесенной дифтерии формируется стойкий постинфекционный иммунитет – • вырабатываются антитоксические антитела, уровень которых в сыворотке крови определяют методом ИФА, РПГА и др.
Дифтерия специфическая профилактика и терапия • Вакцинация детей АКДС-вакциной и далее АДСанатоксином. В комплексную вакцину входит дифтерийный анатоксин (после обработки токсин утрачивает токсигенность и сохраняет иммуногенность) • На территории РФ разрешено использовать зарубежные вакцины: Тетракок 05 (для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и полиомиелита), Имовакс ( содержит дифтерийный и столбнячный анатоксины • Специфическую терапию осуществляют введением антитоксической противодифтерийной (лошадийной) сыворотки
Возбудитель легионеллеза Legionella pneumophila
Этиология Семейство: Legionellaceae Род : Legionella Вид : L. pneumophila
Морфология • • • Gram –отрицательные палочки Неспорообразующие Некапсульные Подвижные Жгутики (полярно расположенные)
Факторы патогенности • Факторы адгезии – белок mip M (адгезия на макрофагах), порин – белок наружной мембраны • Ферменты патогенн ости– металлопротеаза (цитолизин), нарушает фагоцитоз • Фосфолипаза С (подавляет функции нейтрофилов) • Легиолизин (гемолитическая активность) • Каталаза • Фосфатазы, липазы, нуклеазы • Токсические факторы: TS(термостабильный) пептид • TL(термолабильный цитотоксин) подавляет «кислородный взрыв» в фагоцитах, участвует в поражении легких • Эндотоксин (ЛПС) вызывает лихорадку, гипотонию
Антигенные свойства • Легионеллы содержат • 1) жирокислотный комплекс, что может обусловить кожно-аллергические реакции • 2) белковый комплекс – типоспецифический, обладающий протективными свойствами.
Микробиологическая диагностика • В качестве клинического материала используют мокроту и содержимое бронхов • Больной не представляет опасности для окружающих
Микробиологическая диагностика Бактериоскопия (окраска по Граму)
L. pneumophila в ткани (окраска по Граму)
Электронная микроскопия
L. pneumophila (метод серебрения)
L. pneumophila (указано стрелками) Электроная микроскопия
Иммунофлюоресценция
Культуральные свойства • Легионеллы - строгие аэробы • Требовательны к питательным средам. Рост на питательных средах с добавлением аминокислот (цистеина ), для абсорбции ингибиторов в среду добавляют активированный уголь. • Рост бактерий возможен также в куриных эмбрионах и при использовании клеточной культуры. • Условия культивирования: 3 -5 дней при p. H 6. 9 и температуре 35 o. C.
Бактериологический метод колонии легионелл на угольно- дрожжевом агаре
Лабораторные методы 1. ИФА (ELISA) Идентификация антигенов легионелл 2. ИФ (IF) - Прямой и непрямой методы иммунофлюоресценции 3. Серологический метод с выявлением уровня антител в парных сыворотках (4 -кратное повышение титра)
Патогенез легионеллеза
Патогенез • Заражение происходит при ингаляции инфицированной аэрозоли и глотании контаминированных порций воды и льда. • Эти патогены способны размножаться в моноцитах и альвеолярных макрофагах. • Фагоциты не способны на активный киллинг, так как бактерии подавляют слияние фагосомы с лизосомой и тем самым избегают контакта со свободными радикалами- активными формами кислорода.
Легионеллы внутри моноцита человека
Патогенетический цикл L. pneumophila
Профилактика и терапия • Терапия Макролиды(azithromy cin, clarithromycin), Фторхинолоны (ciprofloxacin , levofloxacin) • Профилактика – Контроль за возможной контаминацией – Контроль за хлорированием воды – Контроль за температурой воды – Меры специфической профилак тики не разработаны
Воздушно-капельные инфекции (часть 2).ppt