КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ, ЭПИЗООТОЛОГИИ И

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ, ЭПИЗООТОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ Ведущий преподаватель доктор биологических наук, профессор Нино Нодариевна Гугушвили

Лабораторные занятия по общей микробиологии для факультета ветеринарной медицины

Тема Санитарно-бактериологическое исследование почвы

Задание 1. Ознакомиться с методами определения ОМЧ, коли – титра почвы. 2. Описать выросшие колонии, приготовить мазки, окрасить по Граму, промикроскопировать, зарисовать.

Почва является хорошей средой для обитания микроорганизмов в связи с наличием в ней питательных веществ и влаги. Почва хорошо защищает их от влияния прямого солнечного света, высушивания.

В расчете на 1 г почвы обсемененность может составлять сотни миллионов клеток (глинистые, песчаные) и даже миллиарды (черноземы). Почвы удобряемых сельскохозяйственных участков могут содержать до 5– 8 млрд. клеток. Во влажных нейтральных или слабокислых почвах микроорганизмы находят хорошие условия для размножения, и их там обычно много. В неблагоприятных по свойствам почвах – кислых, болотистых, сухих – микробов меньше.

Особенно обильно населены поверхностные слои (глубина 1– 10 см), так как они постоянно обогащаются питательными веществами за счет отмерших растительных и животных организмов, сточных вод. В верхнем слое (до глубины 1– 2 мм) микробов обнаруживается меньше, чем в более глубоко расположенных горизонтах, из-за губительного воздействия прямого солнечного света, постоянных перепадов влажности и высушивания.

К видам типичных для почв относятся нитрифицирующие, денитрифицирующие, азотофиксирующие, целлюлозоразрушающие, серобактерии, пигментные гнилостные бактерии, плесневые грибы, актиномицеты, водоросли и др.

Из сапрофитных бактерий в почвах много аэробных спорообразующих, в том числе сенная, картофельная палочки, и анаэробных – из группы масляно-кислых и др.

Кроме того, в почвах могут оказываться патогенные микробы, попадающие туда с трупами животных, отбросами (возбудители желудочно-кишечных заболеваний, пищевых отравлений (ботулизм), раневых инфекций и др. ).

Болезнетворные бактерии, как правило, постоянно не обитают в почве, но при попадании в нее могут некоторое время сохраняться. Корни растений (своими выделениями), микробы- антагонисты, частые перепады влажности и температуры оказывают губительное действие на них, вызывая постепенное отмирание. Тем не менее, холерный вибрион, например, выживает в почвах от 1 до 26 недель. Споровые формы более устойчивы – возбудители сибирской язвы, столбняка, ботулизма, газовой гангрены, попав в почву, сохраняются в ней годами, а в некоторых условиях активно в ней размножаются.

Пищевые продукты следует тщательно оберегать от загрязнения почвой, так как с ней могут попасть на продукты микробы, вызывающие порчу, или микробы, опасные для здоровья человека. Из почвы микробы с пылью или с потоками дождевой или снеговой воды попадают в реки, озера и другие природные воды, в воздух. Таким образом, почва является первоисточником микробов в природных условиях.

Объективная оценка санитарного состояния почвы производится по результатам обнаружения в ней бактерий Е. coli (кишечная палочка); Сl. perfringens, Str. faecalis (фекальный стрептококк). Длительность выживания патогенных микробов в почве варьирует: Сальмонеллы (брюшно-тифозные палочки) – от 10 до 250 дней, холерный вибрион – от 5 до 100 дней, Шигеллы (дизентерийные бактерии) – от 15 до 150 дней, Возбудитель чумы – от 5 до 30 дней.

Продолжительность выживания патогенных бактерий в почве Наименование Средний срок, недели Максимальный срок, бактерий недели Холерный вибрион 1– 4 26 Бруцеллы 3 8– 12 Возбудитель чумы 0, 5 4– 5 Возбудитель туляремии 1– 2 9 Шигеллы (дизентерийные 5 39 палочки) Сальмонеллы (брюшно -тифозные палочки) 2– 3 52

Отбор проб для химического, бактериологического и гельминтологического анализов проводят не менее 1 раза в год. Для контроля загрязнения тяжелыми металлами отбор проб проводят не менее 1 раза в 3 года. Для контроля загрязнения почв детских садов, лечебно-профилактических учреждений и зон отдыха отбор проб проводят не менее 2 раз в год – весной и осенью.

При изучении динамики самоочищения отбор проб проводят в течение первого месяца еженедельно , а затем ежемесячно в течение вегетационного периода до завершения активной фазы самоочищения. – Для контроля загрязнения почв сельскохозяйственных угодий в зависимости от характера источника загрязнения, возделываемой культуры и рельефа местности на каждые 0, 5– 20, 0 га территории закладывают не менее 1 пробной площадки размером не менее 10 х 10 м.

Для контроля санитарного состояния почвы в зоне влияния промышленного источника загрязнения пробные площадки закладывают на площади, равной 3 -кратной величине санитарно-защитной зоны. – Для контроля санитарного состояния почв на территории расположения детских садов, игровых площадок, выгребов, мусорных ящиков и других объектов, занимающих небольшие площади, размер пробной площадки должен быть не более 5 х 5 м.

Точечные пробы отбирают на пробной площадке из одного или нескольких слоев или Горизонтов методом конверта, по диагонали или любым другим способом с таким расчетом, чтобы каждая проба представляла собой часть почвы, типичной для генетических горизонтов или слоев данного типа почвы. Количество точечных проб должно соответствовать ГОСТ 17. 4. 3. 01– 83. Точечные пробы отбирают ножом или шпателем из прикопок или почвенным буром.

Объединенную пробу составляют путем смешивания точечных проб , отобранных на одной пробной площадке. Для бактериологического анализа с одной пробной площадки составляют 10 объединенных проб . Каждую объединенную пробу составляют из трех точечных проб массой от 200 до 250 г каждая, отобранных послойно с глубины 0 – 5 и 5– 20 см.

Для гельминтологического анализа с каждой пробной площадки берут одну объединенною пробу массой 200 г, составленную из десяти точечных проб массой 20 г каждая, отобранных послойно с глубины 0– 5 и 5– 10 см. При необходимости отбор проб проводят из глубоких слоев почвы послойно или по генетическим горизонтам.

Все объединенные пробы должны быть зарегистрированы в журнале и пронумерованы. На каждую пробу должен быть заполнен сопроводительный талон.

Пробы почвы, предназначенные для бактериологического анализа , упаковывают в сумки-холодильники и сразу доставляют в лабораторию на анализ. При невозможности проведения анализа в течение одного дня пробы почвы хранят в холодильнике при температуре от 4 до 5°С не более 24 ч. При анализе на кишечные палочки и энтерококки пробы почвы хранят в холодильнике не более 3 сут.

Пробы почвы, предназначенные для гельминтологического анализа , доставляют в лабораторию на анализ сразу после отбора. При невозможности немедленного проведения анализа пробы хранят в холодильнике при температуре от 4 до 5ºС. Для исследования на яйца биогельминтов почву без обработки хранят не более 7 сут. , для исследования на яйца геогельминтов – не более 1 мес.

При хранении проб для предотвращения высыхания и развития личинок в яйцах геогельминтов почву увлажняют и аэрируют один раз в неделю, для чего пробы вынимают из холодильника и оставляют на 3 ч при комнатной температуре. увлажняют водой по мере потери влаги и снова помешают для хранения в холодильник.

При необходимости хранения проб почвы более месяца применяют консервирующие средства. Для этого почву пересыпают в кристаллизатор, заливают раствором формалина с массовой долей 3 ч, приготовленным на изотоническом растворе натрия хлористого с массовой долей 0, 85% (жидкость Барбагалло), или раствором соляной кислоты с массовой долей 3%, а затем ставят в холодильник.

Подготовка проб к анализу Для бактериологического анализа пробы почвы освобождают от включений (корни растений, насекомые, камни, стекло, уголь, кости животных) и новообразований (друзы гипса, известковые журавчики и др. ), при этом со строгим соблюдением условий асептики: почву рассыпают на стерильную поверхность, все операции проводят стерильными инструментами, просеивают почву через стерильное сито с диаметром ячеек 3 мм, накрытое стерильной бумагой. Растирают почву в стерильной ступке. Для гельминтологического анализа пробы почвы освобождают от включений и новообразований.

В почвах на территориях жилой застройки не допускается: - по санитарно-бактериологическим показателям – наличие возбудителей каких-либо кишечных инфекций, патогенных бактерий, энтеровирусов. Индекс санитарно-показательных организмов должен быть не выше 10 клеток/г почвы;

по санитарно-паразитологическим показателям – наличие возбудителей кишечных паразитарных заболеваний (геогельминтозы, лямблиоз, амебиаз и др. ), яиц геогельминтов, цист (ооцисты), кишечных, патогенных, простейших;

по санитарно-энтомологическим показателям – наличие преимагинальных форм синантропных мух; - по санитарно-химическим показателям – санитарное число должно быть не ниже 0, 98 (относительные единицы).

Классы опасности химических загрязняющих веществ Классы Химическое загрязняющее опасности вещество 1 Мышьяк, кадмий, ртуть, свинец, цинк, 3, 4 -бензапирен, фтор 2 Бор, кобальт, никель, молибден, медь, хром сурьма 3 Барий, ванадий, вольфрам, марганец, ацетофенон, стронций

По степени опасности в санитарно- эпидемиологическом отношении почвы населенных мест могут быть разделены на следующие категории по уровню загрязнения: чистая, допустимая, умеренно опасная, чрезвычайно опасная.

Почвы сельскохозяйственного назначения по степени загрязнения химическими веществами разделены на следующие категории: допустимые, умеренно опасные, чрезвычайно опасные.

- допустимая категория почв – содержание химических веществ в почве превышает фоновое, но не выше ПДК; - умеренно опасная категория почв – содержание химических веществ в почве превышает их ПДК при лимитирующем общесанитарном, миграционном водном и миграционном воздушном показателях вредности, но ниже допустимого уровня по транслокационному показателю вредности - опасная категория почв – содержание химических веществ в почве превышает их лимитирующем транслокационном показателе вредности; - чрезвычайно опасная категория почв – содержание химических веществ превышает ПДК по всем показателям вредности.

Гигиеническая оценка почв сельскохозяйственного назначения и рекомендации по их использованию Категория Характеристика Возможное Рекомендации по загрязненности использование оздоровлению почв сти почв территории 1. Содержание Использование Снижение уровня Допустима химических под любые воздействия я веществ в почве культуры источников превышает загрязнения почвы. фоновое, но не Осуществление выше ПДК мероприятий по снижению доступности токсикантов для растений (известкование, внесение органических удобрений и т. п.

2. Содержание Использование Мероприятия, Умеренно химических под любые аналогичные опасная веществ в почве культуры при категории 1 превышает их условии При наличии ПДК при контроля веществ с лимитирующем качества лимитирующим общесанитарном, сельскохозяйст миграционным миграционном венных водным или водном и растений миграционным миграционном воздушным воздушном показателями показателях проводится контроль вредности, но за содержанием этих ниже допустимого веществ в зоне уровня по дыхания с/х рабочих транслокационном и в воде местных у показателю водоисточников

3. Содержание Использование 1. Кроме мероприятий, Высокоопа под указанных для химических сная технические категории 1, веществ в почве обязательный контроль превышает их культуры, за содержанием использование ПДК при токсикантов в под с/х растениях - продуктах лимитирующем культуры питания и кормах. транслокационн ограничено с 2. При необходимости ом показателе учетом выращивания растений вредности растений- - продуктов питания концентраторов рекомендуется их перемешивание с продуктами, выращенными на чистой почве. 3. Ограничение использования зеленой массы на корм скоту с учетом растений- концентраторов

4. Содержание Использование Мероприятия по Чрезвычай под но опасная химических снижению технические веществ культуры или уровня превышает исключение из загрязнения и ПДК в почве сельскохозяйст связыванию по всем венного токсикантов в показателям использования. почве. Контроль Лесозащитные вредности за содержанием полосы токсикантов в зоне дыхания с/х рабочих и в воде местных водоисточников

Рекомендации по использованию почв в зависимости от степени их загрязнения Категории загрязнения Рекомендации по почв использованию почв Чистая Использование без ограничений Допустимая Использование без ограничений, исключая объекты повышенного риска Умеренно опасная Использование в ходе строительных работ под отсыпки котлованов и выемок, на участках озеленения с подсыпкой слоя чистого грунта не менее 0, 2 м

Ограниченное Опасная использование под отсыпки выемок и котлованов с перекрытием слоем чистого грунта не менее 0, 5 м. При наличии эпидемиологической опасности - использование после проведения дезинфекции (дезинвазии) по предписанию органов госсанэпидслужбы с последующим лабораторным контролем

Чрезвычайно опасная Вывоз и утилизация на специализированных полигонах. При наличии эпидемиологической опасности - использование после проведения дезинфекции (дезинвазии) по предписанию органов госсанэпидслужбы с последующим лабораторным контролем

Подготовка проб к исследованию Пробы почвы измельчают, освобождают от посторонних примесей, просевают через сито, тщательно перемешивают и отвешивают 30 г. В колбу ёмкостью 500 мл наливают 270 мл стерильной водопроводной воды и вносят в неё отвешенную пробу почвы, всё интенсивно встряхивают 10 мин. Готовят серию десятикратных последовательных разведений. Подготовленные образцы исследуют.

Постановка опыта по выявлению микробиологических процессов в почве

Определение ОМЧ почвы Из последних 3 -4 -х пробирок с разведённой суспензией отдельными стерильными пипетками вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри (каждое разведение в отдельности). В каждую чашку добавляют ещё по 15 -20 мл расплавленного и охлажденного до 45 о С МПА. Круговыми движениями содержимое чашек перемешивают, оставляют на столе для уплотнения агара.

С застывшей средой чашки переворачивают вверх дном, надписывают и помещают в термостат для культивирования на 24 -48 ч. при 37 о С. Выросшие колонии подсчитывают в каждой чашке, умножают на степень разведения, полученные числа суммируют и вычисляют среднее арифметическое число, что составит количество микробов, содержащихся в одном грамме почвы.

Определение ОМЧ Количество микроорганизмов в 1 г почвы или 1 мл воды рассчитывают по формуле: А – количество колоний на чашке, К – степень разведения почвы, V – объем, высеваемой суспензии на чашку, мл.

Определение коли-титра почвы Разведения суспензии почвы отельными стерильными пипетками засевают в пробирки со средой Кесслера. Посевы выдерживают в термостате при 43 о С в течение 48 ч. Из пробирок, где есть газообразование, высевают штрихом на агар Эндо в чашки Петри, культивируют при 37 о С 24 ч. Красные колонии, выросшие на агаре, типичные для бактерий рода Эшерихиа, исследуют: мазки окрашивают по Граму, микроскопируют.

При обнаружении в мазках полиморфных коротких грамотрицательных палочек колонии вновь пересевают в среду Кесслера для подтверждения газообразования в чистой культуре E. coli. Наибольшее разведение почвенной суспензии, в котором отмечена ферментация лактозы (с газообразованием), соответствует коли-титру почвы.

Показатели чистоты почв по СПМ Категория Титры Количество почвы кишечной нитрифици Cl . термофильны палочки рующих perfringens х бактерий в бактерий 1 г Чистая 1, 0 0, 1 и выше 0, 01 100– 1000 и выше Загрязненная 0, 9– 0, 01– 0, 001 0. 009– 1001– 100 000 0, 0001 Сильно 0, 009 0, 0001 и 0, 00009 10001 – загрязненная и ниже 4000000

Отбор проб почвы На обследуемой территории площадью до 1000 м 2 выделяют участка по 25 м 2 (1 – вблизи источника загрязнения, другой – в отдалении от него). На каждом из двух участков (с соблюдением стерильности) берут пробу из пяти точек (4 – по углам участка, 1 – в центре) на глубине 10 -20 см стерильным совком (из более глубоких мест – с помощью специального бура Некрасова или Френкеля).

Отбирают по 200 -300 г почвы в широкогорлые стерильные банки с ватными пробками (можно все взятые пробы с одного участка перемешать и на исследование направить 1 кг). На банки наклеивают этикетки, отправляют с нарочным и сопроводительным письмом. Пробы почвы полагается исследовать сразу же или в течение 6 -18 ч, сохраняя при температуре не выше 1 -5 о. С.

Подготовка проб к исследованию Пробы почвы измельчают, освобождают от посторонних примесей, просевают через сито, тщательно перемешивают и отвешивают 30 г. В колбу ёмкостью 500 мл наливают 270 мл стерильной водопроводной воды и вносят в неё отвешенную пробу почвы, всё интенсивно встряхивают 10 мин. Готовят серию десятикратных последовательных разведений. Подготовленные образцы исследуют.

Постановка опыта по выявлению микробиологических процессов в почве

Определение ОМЧ почвы Из последних 3 -4 -х пробирок с разведённой суспензией отдельными стерильными пипетками вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри (каждое разведение в отдельности). В каждую чашку добавляют ещё по 15 -20 мл расплавленного и охлажденного до 45 о С МПА. Круговыми движениями содержимое чашек перемешивают, оставляют на столе для уплотнения агара.

С застывшей средой чашки переворачивают вверх дном, надписывают и помещают в термостат для культивирования на 24 -48 ч. При 37 о С. Выросшие колонии подсчитывают в каждой чашке, умножают на степень разведения, полученные числа суммируют и вычисляют среднее арифметическое число, что составит количество микробов, содержащихся в одном грамме почвы.

Определение ОМЧ Количество микроорганизмов в 1 г почвы или 1 мл воды рассчитывают по формуле: А – количество колоний на чашке, К – степень разведения почвы, V – объем, высеваемой суспензии на чашку, мл.

Определение коли-титра почвы Разведения суспензии почвы отельными стерильными пипетками засевают в пробирки со средой Кесслера. Посевы выдерживают в термостате при 43 о С в течение 48 ч. Из пробирок, где есть газообразование, высевают штрихом на агар Эндо в чашки Петри, культивируют при 37 о С 24 ч. Красные колонии, выросшие на агаре, типичные для бактерий рода Эшерихиа, исследуют: мазки окрашивают по Граму, микроскопируют.

При обнаружении в мазках полиморфных коротких грамотрицательных палочек колонии вновь пересевают в среду Кесслера для подтверждения газообразования в чистой культуре E. coli. Наибольшее разведение почвенной суспензии, в котором отмечена ферментация лактозы (с газообразованием), соответствует коли- титру почвы.

Показатели чистоты почв по СПМ Категория Титры Количество почвы кишечной нитрифицирую Cl . термофильных палочки щих бактерий perfringens бактерий в 1 г Чистая 1, 0 0, 1 и выше 0, 01 100– 1000 и выше Загрязненная 0, 9– 0, 01– 0, 001 0. 009– 1001– 100 000 0, 0001 Сильно 0, 009 0, 0001 и ниже 0, 00009 10001 – загрязненная и ниже и ниже 4 000

Благодарю за внимание!