Качественные и количественные методы обработки хроматограмм
Качественная обработка хроматограмм • Основная цель качественной оценки хроматограмм состоит в идентификации содержащихся в пробе веществ либо выявлении определенного компонента в ее составе (скрининг-анализ). • Для идентификации компонентов обычно требуются стандартные образцы тех веществ, наличие которых нужно подтвердить, при этом они должны иметь высокую степень чистоты. • Однако это условие не всегда выполнимо, поскольку некоторые аналиты очень быстро разрушаются либо не могут быть полностью выделены из смесей. • В таких случаях следует использовать другие методы анализа.
Качественная обработка хроматограмм • Проба вводится в хроматографическую систему в том случае, если для идентификации компонентов имеются необходимые эталонные образцы, которые представляют собой индивидуальные аналиты. • При необходимости оптимизацию условий хроматографического разделения осуществляют до тех пор, пока все пики на хроматограмме не будут разделены между собой в достаточной степени. • В критических случаях необходимо проверять, появляется ли пик анализируемого компонента только вследствие наличия компонента либо наблюдается наложение сигналов нескольких аналитов (проявляется в увеличении интенсивностей пиков).
Качественная обработка хроматограмм • Если однородность пиков подтверждена или признана, то вещества могут быть идентифицированы. • Эталонные образцы анализируемых компонентов, наличие которых требуется подтвердить, последовательно вводятся в хроматографическую систему при одинаковых условиях. • В качестве параметра сравнения для идентификации компонентов при стабильном времени удерживания несорбируемого компонента t. M используют значение времени удерживания t. R. Если значение t. M не является стабильным, то для идентификации компонента можно использовать значение исправленного времени удерживания t'R (рис. 2. 57).
Качественная обработка хроматограмм • Однако для полной идентификации пробы недостаточно одного соответствия времен удерживания компонентов. • При наличии большого количества аналитов существует вероятность того, что два различных компонента в равной степени удерживаются в хроматографической колонке и имеют одинаковые времена удерживания. • Поэтому наиболее оптимальным вариантом является дополнительное введение в состав пробы определенного количества чистого компонента, наличие которого было установлено в ходе проведения предварительных исследований. • Затем смесь подвергается хроматографическому анализу и проверяются пики хроматограммы на наличие «плеча» (рис. 2. 58).
Качественная обработка хроматограмм Если образуется такое «плечо» , то, вероятнее всего, оба аналита (анализируемый компонент пробы и введенный эталонный образец) еще не достигли идентичности. При отсутствии «плеча» процесс хроматографического разделения проводят уже с другими условиями. Объектами таких изменений могут быть: • концентрация подвижной фазы (ВЭЖХ); • вид подвижной фазы (ВЭЖХ); • новая колонка ( ВЭЖХ); • скорость подачи подвижной фазы ( ВЭЖХ). • Однако полную идентичность компонента пробы и эталонного образца могут гарантировать лишь результаты гибридного хроматографического и спектроскопического методов (например, ВЭЖХ-МС).
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ НЕХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ В некоторых случаях идентификация неизвестного вещества может быть обеспечена сбором фракции, соответствующей пику хроматографического разделения, и последующим анализом этой фракции физическими или химическими методами. При этом подвижная и неподвижная хроматографические фазы должны быть: • очищенными, чтобы фон от фазы был сведен к минимуму, • они не должны вступать в химическую реакцию с растворенным веществом, • должны быть совместимыми с хроматографической системой, используемой для разделения и обнаружения пика. • Неподвижная фаза не должна выноситься из колонки. • Кроме того, обе фазы не должны мешать идентификации вспомогательными методами и быть летучими, чтобы их можно было легко удалить выпариванием, фракции обычно собирают вручную, хотя возможно применение коллектора фракций.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ НЕХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ • Для обеспечения чистоты, соответствующей пику собираемой фракции, внутренний объем трубки между детектором и выходом канала для сбора фракций должен быть минимальным. Этот объем должен быть измерен и внесены поправки на задержку между регистрацией пика детектором и фактическим выходом пика из канала для сбора фракций. • Фракции удобно собирать в чистые, сухие, защищенные от попадания света сосуды с навинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками во избежание загрязнений. • Возможен барботаж этих фракций чистым азотом или гелием. • Растворители удаляют из образца выпариванием, продувкой газом, нагреванием ИК-лампой. • Воду и смеси органических растворителей с водой удаляют выпариванием или лиофильной сушкой. • Летучие буферные соединения удаляют при повышенных температурах.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ НЕХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ • Масс-спектрометрия — наиболее надежный и полный метод определения структуры вещества, молекулярной массы, его химической формулы. Этот высокочувствительный метод позволяет работать всего с 0, 005 мкг вещества и установить как фрагментарный состав молекулы, так и ее элементное строение. • Для спектрального анализа в инфракрасной области требуется относительно небольшая проба — 5 мкг в твердом виде и 50 мкг в растворе. • Чувствительность повышается при использовании методов, основанных на преобразовании Фурье, при этом достаточно всего 0, 05 мкг пробы. • Этот метод анализа прекрасно дополняет данные, полученные на массспектрометре, и дает информацию о функциональных группах, а иногда и о структуре вещества.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ НЕХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ • Имеется несколько приемов, позволяющих анализировать разделенные на хроматографе вещества с помощью ИК-спектрофотометра. • Наиболее простым является концентрированно на таблетке КВr. Собранную с хроматографа и упаренную до 1— 2 капель фракцию наносят микрошприцем на 5— 10 мг порошка бромида калия, причем каждую новую порцию раствора выпаривают на таблетке, пропуская сухой ток инертного газа. • Другой путь состоит в выпаривании всей собранной фракции в сосуде с выпуклым дном, на котором находится порошок бромида калия. Растворитель полностью удаляют, а порошок бромида калия перемешивают и спрессовывают в микротаблетку. • Таблетку из бромида калия можно непосредственно перенести в зону масс -спектрометр или в ИК-спектрофотометр. Можно вводить концентрированную фракцию в микрокювету спектрофотометра и сканировать, используя компенсирующий растворитель. • Метод, основанный на преобразовании Фурье, дает довольно высокую чувствительность.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ НЕХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ Из других методов идентификации следует отметить • элементный анализ, требующий от 200 до 1000 мкг вещества, • полярографию (0, 01 мкг вещества), • спектрофлуориметрию-, (0, 05 мкг вещества) • спектральный анализ в УФ- и видимой областях (0, 1 мкг). Простым, надежным и удобным способом определения функциональных групп являются цветные селективные реакции, для которых требуется всего 0, 1 мкг вещества. Совпадение времени удерживания и соответствующая цветная реакция являются надежным подтверждением правильности структуры. Иногда достаточно растворитель, применяемый в жидкостной хроматографии, лишь частично упарить, а в некоторых случаях его следует полностью заменить подходящим растворителем. В таблице приведены примеры цветных реакций для опознавания функциональных групп.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ НЕХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Количественная обработка хроматограмм • • • Зависимость между массой m или массовой концентрацией β аналита, попадающего на детектор, и площадью пика А на хроматограмме называется коэффициентом отклика f. Принципиально следует различать, применяются концентрационные детекторы или детекторы, сигнал которых пропорционален массе аналита. При применении детекторов, сигнал которых пропорционален массе аналита, площадь пика зависит от массы пробы в единицу времени. При этом для таких детекторов используется следующее равенство: При применении детекторов, сигнал которых пропорционален концентрации компонента (УФдетектор в ВЭЖХ, ТКД -термокондуктометрический в ГХ), для количественной характеристики аналита используется величина концентрации, например β В выражении V представляет собой объем подвижной фазы, которая протекает через ячейку детектора. Если объем детектора остается постоянным и скорость подвижной фазы не изменяется, то площадь пика также пропорциональна массе введенного аналита:
Количественная обработка хроматограмм • Для количественной оценки хроматограмм в ВЭЖХ применяют четыре различных метода: -- одноточечной калибровки – внешнего стандарта (абсолютной градуировки); – внутреннего стандарта; – добавок.
Количественная обработка хроматограмм Количественное определение содержания компонентов с использованием метода внешнего стандарта (абсолютной градуировки) • Чистое вещество взвешивают и разбавляют в мерной колбе для получения растворов с различными массовыми концентрациями β или массовыми долями w. • Такие растворы называют калибровочными. • В приготовленные таким способом калибровочные растворы можно вносить и другие компоненты, которые по всей вероятности содержатся в пробе ( «матрица» ). • Одинаковые объемы таких растворов дозируют в хроматографическую систему и далее при равных условиях проводят их хроматографический анализ. • Устанавливается математическая зависимость между значениями массовых концентраций анализируемого компонента и соответствующими площадями пиков.
Количественная обработка хроматограмм Количественное определение содержания компонентов с использованием метода внешнего стандарта (абсолютной градуировки) • • • Если набрано достаточное количество данных (от 5 до 10 точек), то полученная зависимость площади пика от массовой доли w или массовой концентрации β является линейной. Определение содержания компонента в таких случаях осуществляют на основании уравнения линейной регрессии. В результате получают «оптимальное уравнение» , представляющее собой математическое уравнение прямой с углом наклона m и значением ординаты b После введения равных объемов раствора пробы на основании «оптимального уравнения» и площади анализируемых пиков определяют концентрацию компонента в пробе (рис. 2. 59). Этот метод применяют только в том случае, если в хроматографическую систему вводят равные количества проб. В ВЭЖХ такой способ введения проб достаточно просто решается
Количественная обработка хроматограмм Количественное определение содержания компонентов с использованием внутреннего стандарта • Для начала следует выбрать вещество, которое будет использоваться в качестве стандарта. • При этом вещество-эталон должно удовлетворять следующим требованиям: – не входить в состав пробы; – иметь достаточно близкие времена удерживания в сравнении с аналитом; – не разрушаться в процессе анализа; – не создавать затруднений при взвешивании. • В качестве вещества-эталона желательно выбирать соединения того же гомологического ряда, что и аналит.
Количественная обработка хроматограмм Количественное определение содержания компонентов с использованием внутреннего стандарта • Далее в отдельном эксперименте определяют так называемый градуировочный множитель fm. • Для этого взвешивают (аналит) и (стандарт) в количестве около 1 г с точностью до 0, 5 мг, затем переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки растворителем. • В хроматограф вводят небольшое количество пробы, которое составляет только 10 мкл. С помощью уравнения (2. 44) можно рассчитать значение калибровочной константы fm: • где, man, тst — массы аналита и вещества-стандарта; • Аан, Аst — соответственно их площади пиков.
Количественная обработка хроматограмм Количественное определение содержания компонентов с использованием внутреннего стандарта • Для гарантирования достоверности лучше повторить операцию определения градуировочного множителя fm несколько раз. Далее непосредственно определяют содержание аналитов в пробе. • Чтобы вычислить массовую долю аналита в пробе, взвешивают 1, 0 г пробы с точностью ± 0, 5 мг. Затем с той же точностью взвешивают около 0, 5 г стандарта, смешав все, производят соответствующие разведения и хроматографируют
Количественная обработка хроматограмм Количественное определение содержания компонентов с использованием внутреннего стандарта • Наконец, рассчитывают массовую долю аналита w: • массовую долю аналита Wan рассчитывают : • где тnp — масса пробы • Уравнение содержит отношение площадей пиков аналита и стандарта. Это отношение не зависит от количества введенной в хроматограф пробы. Так, при небольшом увеличении количества вводимой пробы (в которую предварительно введен стандарт) площади пиков обоих компонентов изменятся, однако отношение площадей пиков останется прежним. • Поэтому этот метод можно использовать даже в тех случаях, когда объемы вводимых проб немного различаются: например, при их дозировании вручную
Количественная обработка хроматограмм Количественное определение содержания компонентов с использованием внутреннего стандарта • Этот метод известен также под названием относительной или косвенной калибровки. Метод основан на добавлении внутреннего стандарта — вещества с известной концентрацией, не присутствующего в первоначальной смеси, в неизвестный образец для получения отдельного пика на хроматограмме и компенсации различных аналитических ошибок. • Таким образом, известное вещество играет роль внутреннего маркера и компенсирует небольшие отклонения параметров разделения на размер пиков. При хроматографировании специально приготовленных смесей с известным массовым соотношением анализируемого вещества и стандарта минимальная погрешность метода составляет 0, 1%.
Количественная обработка хроматограмм Количественное определение содержания компонентов с использованием внутреннего стандарта • При использовании метода возможно исключение аппаратурных и методических погрешностей. Добавление внутреннего стандарта до ввода пробы в колонку позволяет скомпенсировать погрешности, связанные с подготовкой пробы к анализу или получением производных интересующих соединений. • Однако погрешность метода внутреннего стандарта выше, чем метода внешнего стандарта, так как измеряют размеры двух пиков (отношение пиков), а не одного. • Внутренний стандарт должен быть химически инертным, полностью отделяться от других компонентов смеси, концентрация его должна быть близка к концентрации определяемых веществ. • Внутренний стандарт должен быть по возможности аналогичен по структуре определяемым веществам. При таком подходе потеря интересующего нас соединения будет сопровождаться потерей эквивалентной части стандарта.
Количественная обработка хроматограмм Количественное определение содержания компонентов с использованием внутреннего стандарта Калибровочный график для метода внутреннего стандарт
Количественная обработка хроматограмм Количественное определение содержания компонентов с использованием внутреннего стандарта • Калибровку с использованием внутреннего стандарта проводят при хроматографировании смесей, содержащих внутренний стандарт в постоянной концентрации, а интересующий компонент в разных концентрациях. • Измерив площади или высоты определяемых соединений, строят график отношений их к площади или высоте внутреннего стандарта в зависимости от концентрации интересующего компонента. При правильной калибровке график линеен и проходит через начало координат. • Пример калибровки по внутреннему стандарту приведен на слайде. Внутренний стандарт должен вноситься в такой концентрации, чтобы отношение высот Н или площадей S пиков стандартов и компонентов было равно ~1. • При разделении многокомпонентных смесей для достижения наивысшей точности может потребоваться несколько внутренних стандартов. Внутренний стандарт должен иметь с анализируемым веществом сходное значение к 1, аналогичные растворимость и отклик детектора. • Когда трудно найти достаточно близкий аналог-гомолог или изомер, стараются подобрать вещество с одинаковыми растворимостью и откликом детектора.
Количественная обработка хроматограмм Количественное определение содержания компонентов с использованием внутреннего стандарта • Точные количественные измерения проводят в изократическом режиме. • Градиентное элюирование применяют, когда провести изократическое разделение невозможно. Хотя при градиентном режиме получают воспроизводимые результаты, но при градиентном элюировании иногда наблюдается смещение базовой линии и появление ложных пиков из-за наличия в растворителях воды. Кроме того, градиентное элюирование удлиняет время анализа. При количественном анализе в режиме градиентного элюирования необходимо тщательно контролировать скорость потока, если измеряют площади пиков, и соблюдать постоянство градиентного изменения состава подвижной фазы, если измеряют высоты пиков. • Для анализа смесей компонентов, характеризующихся широким диапазоном значений к 1, предпочтение следует отдавать изократическому разделению с переключением колонок, а не градиентному
Количественное определение содержания компонентов с использованием метода добавок • В методе добавок за внутренний стандарт принимают пик, расположенный рядом с пиком аналита; • при этом вводят дополнительное количество чистого анализируемого компонента. • Этот метод преимущественно применяют в том случае, когда анализируемый компонент содержится в низких концентрациях, а соседние пики хорошо разделены между собой и имеют близкие значения площадей. На слайде представлен идеальный вид такой хроматограммы.
Количественное определение содержания компонентов с использованием метода добавок • • Сущность метода можно пояснить на простом примере. Для пробы в количестве V= 1 мкл получают следующие значения площадей пиков: Аналитический пик (пик аналита)…………………. 10 ООО усл. ед. Соседний пик (внутренний стандарт)…………. . 8 ООО усл. ед. К 10 г пробы дополнительно прибавляют 0, 100 г чистого аналита, затем снова анализируют 1 мкл пробы, что дает следующие значения площадей пиков: Аналитический пик……………. 18 000 ед. Соседний пик …………. 10 000 ед.
Количественное определение содержания компонентов с использованием метода добавок • Так как в состав смеси дополнительно не вводили вещество, пик которого принят в качестве внутреннего стандарта (соседний пик), то различие площадей пиков этого компонента (10 000 и 8000 ед. ) можно объяснить погрешностью ручного ввода пробы. • Следовательно, при проведении второго процесса хроматографии было введено большее количество пробы. • Однако соотношение VH для аналитического и соседнего пиков остается прежним. • Вычислим соотношение VH в первоначальной пробе:
Количественное определение содержания компонентов с использованием метода добавок • На основании соотношения VH = 1, 25 и площади соседнего пика Асп по формуле • можно рассчитать площадь анализируемого компонента в смеси, не учитывая при этом введение дополнительного количества анализируемого компонента: • Если бы в пробу не вводили дополнительное количество анализируемого компонента, то при введении большего количества пробы площадь пика А составила бы 12 500 ед
Количественное определение содержания компонентов с использованием метода добавок • Однако площадь пика компонента после введения дополнительного количества аналита составляете = 18 ООО ед. : разница между A=18000 ед А = 12 500 ед составляет А = 5500 ед. и объясняется увеличенным содержанием аналита (т = 0, 100 г). • Это свидетельствует о наличии прямой связи между массой и площадью пика аналита. По простой пропорции можно рассчитать массу тан в пробе, в которую не вводили добавку, на основании значения площади аналита Аан = 10 000 ед
Определение количественного содержания испытуемого образца в фармацевтической промышленности с применением внешнего стандарта. 1. Определение пригодности хроматографической системы (для определения прописывается не менее 5 хроматограмм). Эксперименты по определению пригодности хроматографической системы являются неотъемлемой частью методов жидкостной хроматографии при определении посторонних примесей. Они используются для подтверждения того, что разрешающая способность и воспроизводимость хроматографической системы адекватны анализам, которых необходимо произвести. Эксперименты соответствуют концепции, согласно которым оборудование, электроника, аналитические операции и образцы для анализа составляют целую рабочую систему.
Определение количественного содержания испытуемого образца в фармацевтической промышленности с применением внешнего стандарта. 1. Определение пригодности хроматографической системы (для определения прописывается не менее 5 хроматограмм). • е Определение относительного стандартного отклонения площади пика основного вещества (δ 5) - среднее значение площади пика основного вещества • Определение фактора асимметрии пика основного вещества (Т). • • где, W 0, 1 – ширина пика на 10 % высоты, мин а- расстояние от фронта пика до его высоты, измеренное на 10 % высоты, мин.
Определение количественного содержания испытуемого образца в фармацевтической промышленности с применением внешнего стандарта • Определение эффективности колонки (N). Где, t. R –время удерживания пика, мин; W 0, 5 – ширина пика на половине его высоты, мин; • Определение критерия разделения пиков (R). где, t. R –время удерживания соответствующего пика, мин; W 0, 5 – ширина соответствующего пика на половине его высоты, мин;
Определение количественного содержания испытуемого образца по одноточечной калибровке • Где, Х – содержание активного вещества, в номинальной массе испытуемого материала г, (%); S i –площадь основного пика на хроматограмме испытуемого раствора; S 0 – площадь основного пика на хроматограмме раствора РСО; ai – навеска порошка испытуемого материала, г; a 0 – навеска РСО, г; V – объем разведения испытуемого раствора, мл V 0 – объем разведения стандартного образца, мл b – номинальная масса испытуемого материала , г
Измерение высоты пика • Так как высота пиков менее зависит от влияния соседних перекрывающихся пиков, оценка по высоте пика точнее, и ее почти всегда используют при анализе микропримесей.
Типичные «тривиальные» неисправности, которые могут возникнуть при эксплуатации оборудования для ВЭЖХ • Ошибка Возможная причина Возможный способ устранения ошибки Отсутствие герметичности Негерметичность соедине- Фиксация всех мест соединий нений узлов, замена всех соединительных элементов • То же Износ уплотнений Замена уплотнительных элементов • Воздух Растворитель содержит Удаление воздуха с помо воздух щью дегазатора, введение • гелия • То же Процесс перемешивания Осуществление дегазации • растворителя после переме • шивания до подачи на насос • Загрязнение Используется растворитель Фильтрация растворителя • с недостаточной степенью через мембранный фильтр • чистоты • То же Проба содержит мельчай- Фильтрация пробы, исполь • шие частички зование предварительной • колонки •
Поиск ошибок с помощью анализа ВЭЖХ-хроматограмм • • • Если на хроматограмме обнаруживают признаки ошибок, то для начала нужно определить, относятся они ко всем пикам либо только к одному (или нескольким). При этом следует учитывать, что легче выявить несоответствие пиков тех компонентов, которые характеризуются высоким значением времен удерживания. Если изменилось положение всех пиков, то причиной этого вероятнее всего является повреждение конструктивных узлов или всей установки. Если же изменилось положение только одного пика, то это свидетельствует о «химическом взаимодействии» между аналитом и хроматографической системой. Если на всех пиках в ВЭЖХ наблюдается образование «плеча» , — вероятно, это обусловлено повреждением упаковки колонки, т. е. в начале колонке отсутствует часть неподвижной фазы. Если плечо образуется только на одном пике, то это свидетельствует о том, что условия разделения не являются оптимальными, т. е. пик одного аналита накладывается на пик другого.
Поиск ошибок с помощью анализа ВЭЖХхроматограмм • Ошибка: колебания времен удерживания пиков • Возможные причины: • изменение скорости потока подвижной фазы (насос); • температура в колонке не является оптимальной (отсутствует термостат колонки, изменяется температура в помещении, где установлен хроматограф); • изменение состава растворителя • время установочной работы прибора не является достаточным, колонка еще не находится в равновесии; • отсутствие герметичности в системе ввода пробы; • неверное значение р. Н растворителя.
Поиск ошибок с помощью анализа ВЭЖХхроматограмм Ошибка: низкая селективность (низкие значения фактора разделения соседних пиков) • Возможные причины: • хроматографическая колонка загрязнена либо истек срок ее эксплуатации; • предварительная колонка загрязнена; • при градиентном элюировании насос работает неточно; • изменяется градиент элюирования, • температура не является постоянной; • для подготовки проб применяется растворитель, отличающийся по свойствам от элюента; • значение р. Н элюента не соответствует химической природе анализируемых компонентов: • используется неподходящий буфер либо буферная емкость элюента недостаточна.
Поиск ошибок с помощью анализа ВЭЖХхроматограмм • • • Ошибка: изменяется симметрия пика Возможные причины: перегрузка колонки, введение пробы слишком большого объема; засорение пористого стеклянного фильтра в хроматографической колонке; хроматографическая колонка загрязнена; хроматографическая колонка не пригодна для разделения анализируемой смеси; хроматографическая колонка содержит активные участки плохая упаковка колонки; использование буфера с несоответствующим значением р. Н или отсутствие буфера.
Поиск ошибок с помощью анализа ВЭЖХхроматограмм • Ошибка: слишком высокое значение базовой линии • Возможные причины: • установлена слишком высокая чувствительность системы обработки данных; • непостоянство потока подвижной фазы, пульсация насоса; • пузырьки воздуха в системе; • засорение хроматографической колонки или подводящих проводов; • слишком высокое значение собственного поглощения растворителя (границы пропускания) при данной длине волны; • слишком низкая интенсивность лампы; • кюветное отделение (ячейка) детектора загрязнена; • использование несоответствующего градиента растворителей; нарушение работы электронного оборудования.
Поиск ошибок с помощью анализа ВЭЖХхроматограмм Ошибки хроматограммы, представленные на слайде • При сравнении значений времен удерживания компонента и разрешения пика устанавливают, что изменились времена удерживания всех пиков и разрешения тех из них, что расположены в конце хроматограммы. Причинами этого могут быть: • изменения состава растворителя; • установление неправильного значения р. Н; • изменение растворителя; • изменение температуры, • загрязнение колонки. •
Скачать презентацию Качественные и количественные методы обработки хроматограмм Качественная
4 ВЭЖХ кач и колич 1.ppt