Изучение молекулярных механизмов везикулярного мембранного транспорта Владимир Лупашин

Изучение молекулярных механизмов везикулярного мембранного транспорта Владимир Лупашин October, 2013

Внутриклеточный мембранный транспорт в клетках эукариот George Palade James Rothman Randy Schekman

Двусторонний внутриклеточный мембранный транспорт Плазматическая мембрана Ядро Эндосомы ЭПР Аппарат Гольджи Лизосомы /Вакуоль

Стадии везикулярного транспорта белки, образующие покрытие везикул Bonifacino and Glick, 2004

Мембрана - Акцептор GDP GTP GDP Транспортная везикула I. Причаливание 1 (Tethering) GTP II. активирование Rab Модель для захвата, причаливания и слияния транспортных везикул III. Причаливание 2 IV. Слияние - Coiled-coil tethers - Rab GEF - Oligomeric tether - Rab GTPase - SNAREs

Многокомпонентные белковые комплексы регулируют "причаливание" транспортных везикул vesicle-Tether-target membrane PM Exocyst Эндосомы Dsl 1/ZW 10 GARP Ядро Аппарат Гольджи TRAPP I ЭПР TRAPP II COG HOPS CORVET Лизосомы

The COG (Conserved Oligomeric Golgi) / Консервативный Олигомерный Гольджи комплекс 1. 8 белковых субьединиц (70 -110 k. Da), с двух субкомплексах 2. переферический мембранный белок, ассоциированный с цистернами Гольджи 3. Эволюционно консервативен 4. Родственнен комплексам Dsl 1, exocyst и GARP (семейство CATCHR) 5. Функционирует в распознавании и захватывании транспортных везикул 6. Физически и функционально взаимодействует с основными компонентами механизма слияния везикул 7. Мутации в COG комплексе вызывают наследственные дефекты гликозилирования II типа Елена Суворова

Молекулярная композиция дрожжевого COG комплекса LOBE-A 5 4 1 2 3 7 6 8 LOBE-B Арнольд Борисович Циоменко In vivo interactions 2 Hybrid interactions GST Pull Down interactions Сергей Золов

Дрожжевой Cog 1 p необходим для ассоциации Lobe A и Lobe B суб-комплексов LOBE– A Cog 1 p ∆cog 1 + p∆80 -COG 1 Wt ∆cog 1 + p. COG 1 иммунопреципитат ∆cog 1 + p∆80 -COG 1 Wt ∆cog 1 + p. COG 1 тотальный лизат * * Cog 1 -80 p Cog 2 p Cog 3 p * Cog 5 p LOBE– B Cog 4 p * Cog 6 p Cog 7 p Cog 8 p TAP-COG 2 pull-downs Fotso et al. , JBC, 2005

Многокомпонентные белковые комплексы структурно похожи Richardson, Smith, et al. (PNAS, 2009)

Дефекты COG комплекса приводят к накоплению транспортных везикул, дефектам гликозилирования и нарушению функции Аппарата Голджи

Дефекты COG комплекса приводят к накоплению транспортных везикул Control He. La cells COG 4 KD He. La cells, high-pressure frozen Irina Pokrovskaya

Дефекты COG комплекса приводят к накоплению транспортных везикул Glc. NAc. T 1/GM 130 Control COG KD накопление транспортных везикул в клетках с нарушенным синтезом Cog 3 p

Дефекты COG комплекса приводят к дефектам гликозилирования Control He. La Cog 3 KD Cog 4 KD CHO DCOG 1 DCOG 2 Cog 6 KD Cog 8 KD окраска клеток маннозоспецифичным лектином GNL из Galanthus nivalis Richard Smith

если COG не в порядке… Мутация в Cog 1’s Мутация в Cog 7 point mutation in a splice site Мутация в Cog 8 Common clinical appearances include; hypotonia, mental retardation, liver malfunction, dysmorphia and seizures. These neurological and developmental abnormalities are associated with defects in processing of glycan chains. Foulquier et al. (2006), Morava et al. (2007)

COG комплекс доминирует на нейрональном Гольджи Cog 3/Tau 2/DAPI Cog 6/Tau 2/DAPI DRG rat neurons

COG комплекс локализован на мембранах Гольджи и в цитозоле а ан ль о бр оз м ит ме ц Lobe A Lobe B { Cog 3 { CFP-Cog 6 p Cog 6 Cog 4 Cog 8 Control GAPDH Vti 1 a m. Kate-Cog 4 p YFP-Cog 3 p

Субъединицы COG комплекса ассоциируют с мембранами Гольджи с различной скоростью BLEACH 0 sec 100 sec 300 sec Cycling kinetics of YFP-Cog 3 and monomeric-Ds. Red-Cog 6 in a FRAP assay.

Сборка и разборка COG комплекса регулирует эффективность распознавания и причаливания транспортных везикул Rab protein Budding Loading Lobe B Glycosylation enzymes Lobe A v-SNARE t-SNAREs Approach Tethering and SNARE complex stabilization Fusion

How COG complex functions? Взаимодействие COG комплекса со SNARE белками

исследование COG-SNARE взаимодействия с помощью дрожжевой 2 -гибридной системы COG 4 COG 6 COG 8 COG 4 COG 6 -His Empty GS 2 7 SNA P 29 STX 16 GS 2 7 STX 5 Empty BD 5 6 16 29 TX STX 27 AP p S S G SN Em ty -Leu/-Ura COG AD STX 6 STX 5 SNAREs BD fusion GS 15 COG 8 Empty COG 6 COG 8 -Ade COG 4 Stx 5 GS 27 GS 28 ST X 5 VAMP 4 Stx 16 Stx 6 Vti 1 SNAP 29? Tetyana Kudlyk

Если COG комплекс взаимодействует со SNAREs и оркеструет везикулярный транспорт в Аппарате Гольджи

Мы можем “трансплантировать” COG субьединици на другую органеллу, например, на митохондрию

И, возможно, перенаправить везикулярный транспорт внутри клетки

переадресовка COG комплекса на митохондрии Аппарат Гольджи (зеленый сигнал) Клетки He. La экспрессирующие флюоресцентный белок m. Cherry с митохондриальным сигналом m. Cherry ACTA Клетки He. La экспрессирующие COG 4 - m. Cherry с митохондриальным сигналом h. COG 4 si. RNAresistant m. Cherry ACTA Ирина Покровская

Фрагментация Аппарата Гольджи и коллапс митохондрий вызваны переориентацией COG-зависимого везикулярного транспорта COG 4 -m. Cherry-MTS Golgi vesicle marker Mitochondria marker Ирина Покровская

COG 4 -m. Cherry-Act. A специфически перераспределяет другие субьединицы COG комплекса на митохондрию h. COG 4 si. RNAresistant COG 4 -Act. A GFP-COG 3 GFP-COG 6 m. Cherry ACTA p 115 Giantin Irina Pokrovskaya, Tetyana Kudlyk

COG 4 -m. Cherry-Act. A регулирует переаддресовку весикул, несущих SNARE STX 5 на митохондрию COG 4 -m. Ch-Act. A Stx 16 GFP-Stx 5 p 115 COG 4 -m. Ch-Act. A GFP-Stx 16 Giantin COG 4 DN-m. Ch-Act. A Stx 5 GFP-Stx 5 PDI Stx 5 Irina Pokrovskaya, Tetyana Kudlyk

Complete docking complex is essential for the recruitment GFP-STX 5 -containing membranes to the mitochondria region COG 4 -m. Ch-Act. A GFP-Stx 5 Giantin COG 4 -m. Ch-Act. A GFP-Stx 5 COG 8 COG 4 mut-m. Ch-Act. A GFP-Stx 5 Giantin Stx 5 COG 1 KD Stx 5 SM Stx 5 h. COG 4 SM- mutant m. Cherry ACTA Irina Pokrovskaya, Tetyana Kudlyk

Widefield 3 D-SIM Confocal TEM

Mitochondria clusters COG 4 -m. Ch. Act. A + GFP-STX 5 COG 4 -m. Ch. Act. A M M M a. GFP-Gold M GFP-STX 5 Golgi M M M a. GFP-Gold

COG 4 -m. Cherry-Act. A регулирует переаддресовку весикул, несущих SNARE STX 5 на митохондрию Golgi STX 5 COG 4 m. Che rry. Act. A m. Ch. Act. A GFP-STX 5 COG 8 -m. Ch. Act. A GFP-STX 5

COG 8 -m. Cherry-Acta. A specifically recruits lobe B subunits to mitochondria ACTA h. COG 8 m. Cherry si. RNAresistant COG 8 -m. Ch-Act. A GFP-COG 4 Giantin COG 8 -m. Ch-Act. A GFP-COG 6 Giantin Irina Pokrovskaya, Tetyana Kudlyk

Membrane-bound COG is partially split into distinct lobe A (COG 14) and lobe B (COG 5 -8) sub-complexes 25 Gel Filtration: Cog 8 20 15 Cog 8 Cytosol 10 Cog 8 membrane 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C M Contr ol COG 3 si. RNA Rose Willett

Only full-length COG 8 -Act. A would orchestrate the redirection of STX 16 vesicles to the mitochondria region COG 8 -m. Ch-Act. A 16 5 16 COG 8 -m. Ch-Act. A COG 8 DN-m. Ch-Act. A GFP-Stx 16 Giantin GFP-Stx 5 Giantin GFP-Stx 16 ERGIC 53 Irina Pokrovskaya, Tetyana Kudlyk

COG 8 -m. Ch. Act. A + GFP-STX 16 M M M COG 8 -m. Ch. Act. A M M M M GFP-STX 16 M M Golgi M M a. GFP-Gold

COG 8 -m. Cherry-Act. A регулирует переаддресовку весикул, несущих SNARE STX 16 на митохондрию Golgi STX 16 COG 8 m. Cherry. Act. A

COG регулирует функциональную организацию двух расличных SNARE комплексов в аппарате Гольджи VAMP 4 GS 15 Stx 16 Stx 5 GS 27 GS 28 Stx 6 Vti 1

Conclusions o Using yeast two hybrid and co-immunoprecipitation approaches, we show that three COG subunits, namely COG 4, 6, and 8, are capable of interacting with defined Golgi SNAREs, namely STX 5, STX 6, STX 16, GS 27, and SNAP 29. o Comparative analysis of COG 4 -STX 5 and COG 8 -STX 16 interactions by a COG-based mitochondrial re-localization assay reveals that the COG 8 and COG 4 proteins initiate the formation of two different tethering platforms that can facilitate the redirection of two populations of Golgi transport intermediates to the mitochondrial vicinity. o COG sub-complexes are sufficient to forms spatial landmarks for distinct Golgi SNARE complexes

Lupashin’s lab Tetyana Kudlyk Irina Pokrovskaya Jackob Szwedo Rose Willett Pierre Fotso Benedict Igwe Galimat Khaidakova Svetlana Kononova Oleksandra Pavliv Bridgette Rooney Jacob Seiter Anna Shestakova Richard Smith Elena Suvorova Sergey Zolov Collaborators: Rainer Duden (University of Lubeck) Hudson Freeze (Burnham Institute) Fred Hughson (Princeton) Willy Morelle (University of Lille) Uma Nagarajan (Pittsburg) James Paton (University of Adelaide) Brian Storrie (UAMS) Elizabeth Sztul (UBA) Daniel Ungar (University of York)

COG комплекс необходим для транспорта Sub. AB токсина Subtilase cytotoxin (Sub. AB)

Дефекты COG комплекса приводят к нарушению транспорта Sub. AB токсина Smith, et al. (Traffic, 2009)

внутриклеточный паразит Хламидия (Chlamydia trachomatis) использует компоненты везикулярного транспортного аппарата для выживания и размножения Entry Golgi Elementary body (EB) N 2 -8 h Release 24 -40 h 12 -18 h

внутриклеточный паразит Хламидия использует компоненты везикулярного транспортного аппарата LPS COG 8 Merged LPS COG 3 Merged

Коллабораторы: UAMS: Лаборатория в Медицинском Университете города Little Rock, AR, USA: Fusun Kilic Uma Nagarajan Ирина Покровская Brian Storrie Татьяна Кудлик Richard Smith Rose Willett Rainer Duden (Royal Holloway) Jacob Seiter Hudson Freeze (Burnham Institute) Fred Houghson (Princeton) Сергей Золов Willy Morelle (University of Lille) Елена Суворова James Paton (University of Adelaide) Анна Шестакова Elizabeth Sztul (UBA) Пьер Фотсо Daniel Ungar (University of York) Galimat Khaidakova Oleksandra Pavliv Финансовая поддержка: Ben Igwe Арнольд Борисович Циоменко Светлана Кононова National Science Foundation National Institute of Health

1. общая модель 2. везикулярный мембранный транспорт (стадии) 3. Механизм распознавания и слияния везикул 4. малые ГТФазы РАБ семейства функционируют перед белками СНАРЕс, обеспечивающими слияние липидного бислоя (статья в Science ) 5. РАБ белки оперируют через эффекторы 6. Многообразие РАБ ффекторов 7. Белковые комплексы, регулирующие распознавание мембран 8. Консервативный Олигомерный Голджи комплекс (КОГ), открытие (Лена, JCB) 9. Архитектура КОГ комплекса (Арнольд, Пьер, JCB, JBC) 10. Дефекты КОГ комплекса приводят к накоплению транспортных везикул, дефектам гликозилирования и нарушению функции Аппарата Голджи (Сергей, Аня, Ричард, JCB, Traffic, MBOC, Traffic) 11. Релокализация КОГ комплекса на митохондрии позволяет определить специфические функции КОГ комплекса (Ирина) 12. Заключение и переспективы

COPII vesicle cycle Prof. Randy Schekman Chapter 14 Lodish 6 e

Vesicle trafficking stages Budding Donor membrane Transport vesicle Vesicle coat Tethers Rab GTPase T-SNARE Target membrane Tethering/docking Fusion

COG комплекс используется внутриклеточными паразитами