Изучение биологических и физико-химических свойств полифункционального фермента рекомбинантной дестабилазы медицинской пиявки Hirudo medicinalis Аспирант 2 года обучения Курдюмов Алексей Научный руководитель: заведующий лабораторией генной инженерии ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России, доктор биологических наук, доцент Лазарев Василий Николаевич
Дестабилаза медицинской пиявки – полифункциональный фермент 1) изопептидазная активность Свойство ε-(γ-Glu)-Lys-изопептидаз: изопептидолиз связей ε-(γ-Glu)-Lys, соединяющих мономеры в Д-димере 2) лизоцимная активность Разрушение клеточных стенок бактерий путём гидролиза (1, 4β)-гликозидной связи между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином 3) антимикробная активность Фермент блокирует рост различных микроорганизмов Активность проверялась на грам-положительных бактериях (Micrococcus luteus), грам-отрицательных (Escherichia coli), грибах (Botrytis cinerea), дрожжах (Candida guillermoudii), археях (Methanosarcina barkeri).
Цель работы Получение изоформ дестабилаз медицинской пиявки и изучение их структурной организации и ферментативных свойств
Полученные формы трёх изоформ дестабилаз α N-гидрофильная часть сигнального пептида С-гидрофильная часть сигнального пептида COOH NH 2 6 His β γ гидрофобная часть сигнального пептида NH 2 дестабилаза (Dest 1 -3) COOH NH 2 COOH
Сравнение лизоцимной и изопептидазной активности 1800 80 1600 70 1400 ΔOD 405*1000 2000 90 % активности HEWL 100 60 50 40 30 1200 1000 800 600 20 400 10 200 0 0 1α 1β 1γ 2α 2β 2γ 3α 3β 3γ Лизоцимная активность 1α 1β 1γ 2α 2β 2γ 3α 3β 3γ Изопептидазная активность
Антимикробная активность
Получение растворимой формы дестабилазы Dest-Chap 6 His сайт TEV протеазы NH 2 COOH дестабилаза-2 Sly. D шаперон обработка TEV протеазой выделение дестабилазы из смеси NH 2 COOH Dest-Chap
Получение рекомбинантной дестабилазы в клетках дрожжей Pichia pastoris (Dest-Yeast) Основные преимущества получения рекомбинантных белков в дрожжах: 1) Посттрансляционные модификации 2) Секреция в культуральную среду 3) Высокий выход целевого белка 8 сигнальных пептидов 4 штамма с различной комбинацией делеций генов протеаз Δpep 4 и Δprb 1 2 вектора низкой и высокой копийности плазмид Высокая копийность Низкая копийность
Сравнение лизоцимной и изопептидазной активности 800 3000 700 2500 ΔOD 405*1000 % активности HEWL 600 500 400 300 2000 1500 1000 500 100 0 3γ 0 3β Chap Yeast Лизоцимная активность Изопептидазная активность
Скачать презентацию Изучение биологических и физико-химических свойств полифункционального фермента рекомбинантной
5d7cc9076b2416e1489744a9650e7c7c.ppt