История открытия ДНК и доказательства ее генетической роли

История открытия ДНК и доказательства ее генетической роли * В 1869 году Мишер выделил ядра из белых кровяных клеток и продемонстрировал, что они содержат новое фосфорорганическое соединение ( «нуклеин» ) * К концу 19 века нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) были очищены и началось их изучение В 30 годы 20 века было показано, что нуклеиновые кислоты состоят из сахара (рибозы или дезоксирибозы) и четырех (пяти) типов азотсодержащих оснований. Было также показано, что основания ковалентно связаны с остатком сахара В 1953 году

Пуриновое или пиримидиновое основание Фосфат Пентоза OH Рибоза H Дезоксирибоза Нуклеозид Нуклеотид

Цепь ДНК имеет направление

Толщина спирали позволяла предположить, что она состоит из двух или трех цепей ДНК

Уотсон и Крик предположили, что молекула ДНК представляет собой двойную спираль, в которой две цепи связаны посредством образования водородных связей между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями

Модель Уотсона – Крика ( «B» форма ДНК) 5’-P 3’-OH большая бороздка малая бороздка 3’-OH 5’-P цепи антипараллельны 10 пар на виток, основания в плоскости повернуты друг к другу на угол -36⁰

Двунитевая РНК и ДНК-РНК гибриды находятся в растворе в А форме

Z форму при определенных условиях принимают поли d. G/d. C последовательности GCGCGCG Последовательности, способные образовывать Z форму, присутствуют в промоторах некоторых генов. Можно получить антитела к Z ДНК. С использованием этих антител было продемонстрировано, что Z ДНК может существовать в живой клетке. Однако, существуют опасения, что сами по себе антитела стабилизируют короткоживущую Z форму

Z форма левозакрученная спираль шаг 45, 6 Å ; ~12 п. н. на виток В Z ДНК основания перевернуты

А форма В форма Z форма

Вращение одной пары относительно другой Twist Z 3’ X 5’ Tilt Roll Y 5’ 3’

Смещение одной пары относительно другой Rise Shift Slide 3’ Z X 5’ Y 5’ 3’

смещения оснований внутри одной пары

В малую и большую бороздки ДНК экспонированы РАЗНЫЕ атомы В DS ДНК Уотсон-Криковские пары замкнуты. Они не участвуют в узнавании каких-либо лигандов

A – acceptor D – donor

Специфические комбинации донорных и акцепторных сайтов в большой и малой бороздках ДНК узнаются РАЗЛИЧНЫМИ белками!!! большая бороздка

Non-Watson-Crick Base Pairing, e. g. , Hoogsteen Base Pairing Allow the formation of triple-stranded helices

Triple Helical DNA: H-DNA structure can form when you have a homopurine stretch on a strand (so homopyrimidine stretch on the other strand). H-DNA has been implicated in the regulation of several genes.

quadruplex

Quadruplex DNA часто присутствует в теломерах, в том числе у человека

Обращенные повторы могут образовывать петли

Крестообразные структуры в ДНК Holliday junction

Плоскости соседних пар оснований не строго параллельны. Каждая комплементарная пара оснований является как бы клином, отклоняющим ось спирали в одном или в другом направлении. Наибольший ≪крен≫ наблюдается тогда, когда два соседних аденина в одной цепи спарены с двумя тиминами другой. В этом месте происходит локальное искривление спирали. Если такие пары встречаются с периодичностью примерно один раз на 10 пар (т. е. один раз на каждый виток спирали), то молекула ДНК приобретает заметно искривленную форму.

Суперспирализация ДНК

DNA supercoiling L = linking number = число перекрещивания цепей (число раз, когда одна цепь пересекает другую) T = twist = число витков двойной спирали W = writhe = число супервитков L=T+W s = supercoiling density = (L – L 0) / L 0 = DL / L 0 обычно s ~ -0. 06 (меньше одного супервитка на 17 витков ДНК)

Для замкнутых кольцевых ДНК «L» (Linking number) постоянен (является топологической константой)

Локальное плавление

Бромид этидия интеркалирует в ДНК, уменьшая спирализацию ~ на 26° (разворачивает двойную спираль)

Эффект обработки повышающимися концентрациями интеркалирующего агента на отрицательно суперспирализованную плазмиду скорость седиментации ДНК W<0 концентрация бромида этидия W>0

Топоизомеразы регулируют топологию ДНК Топоизомераза I - вносит временные (eukaryotes, prokaryotes) однонитевые разрывы - релаксирует супервитки Топоизомераза II - вносит временные двунитевые (eukaryotes) разрывы - релаксирует супервитки, разделяет катенаны Гираза - генерирует негативные супервитки, используя энергию АТФ (prokaryotes) Обратная гираза (thermophiles) - генерирует позитивные супервитки

• ∆L = ± 1 per cycle • Cleaves a single strand • Passes broken single strand around the other, then rejoins strands • Does not require ATP • Relaxes supercoiled DNA

Topoisomerase I mechanism All topoisomerases cleave DNA using a covalent Tyrosine-DNA intermediate Because the relaxation (removal) of DNA supercoils by Topo I is energetically favorable, the reaction proceeds without an energy requirement.

Topoisomerase II mechanism

Topoisomerase II В отличии от topo I, фермент topo II нуждается в ATP для своей работы. Topo II в основном активен в пролиферирующих клетках эукариот. Вследствие этого, он является эффективной целью в онкотерапии.

Репликация ДНК 1. Репликация ДНК осуществляется согласно полуконсервативной модели 2. Репликация ДНК происходит двунаправленно

DNA Polymerase-palm domain Содержит два активных центра, один осуществляет полимеризацию, другой – удаление ошибочно включенных нуклеотидов. Полимеразный домен осуществляет контроль правильности спаривания посредством контактов с основаниями в области малой бороздки

DNA Polymerase-thumb domain Прямо не участвует в катализе Взаимодействует с матрицей и синтезирующейся ДНК с тем, чтобы обеспечить правильную позицию праймера относительно активного центра, одновременно препятствуя «соскакиванию» полимеразы с ДНК

DNA Polymerase-finger domain Связывает d. NTP, и помещает правильно спаренные d. NTP в каталитический центр Связывает матрицу и обеспечивает экспонирование основания, с которым должен спариваться очередной d. NTP

ДНК полимераза использует один и тот же каталитический центр для включения в ДНК четырех разных нуклеотидов При этом важное значение имеет мониторинг правильного спаривания. Включение ошибочного нуклеотида резко снижает скорость катализа

Важными характеристиками ДНК-полимераз являются точность работы (Fidelity) и процессивность.

Обладающая полимеразной активностью субъединица ДНК полимеразы III характеризуется очень низкой процессивностью (10 нуклеотидов). Процессивность синтеза обеспечивается бета субъединицей, удерживающей полимеразу на ДНК. Для посадки бета-субъединицы на ДНК необходимы дополнительные белки β-clamp Clamp loader DNA polymerase III holoenzyme

ДНК-праймаза освобождается ДНК-полимераза III Освобождается из комплекса с ДНК и бета-кольцом, но остается связанной с репликативной вилкой

бета-кольцо закрепляет новосинтезированный праймер на отстающей цепи

ДНК-полимераза III прикрепляется к бета-кольцу и начинает синтез очередного фрагмента Оказаки

У E. Coli установку скользящего зажима осуществляет g комплекс, состоящий из 5 субъединиц. g комплекс обладает АТФазной активностью. Связанный с АТФ g комплекс взаимодействует с b кольцом и разрывает его. После гидролиза АТФ g комплекс перестает удерживать разорванное b кольцо и оно вновь замыкается

РНК праймер 3’ pol III E. coli 5’ 5’ ДНК полимераза III 3’ 5’ 5’ Новосинтезированные фрагменты ДНК (100 -1000 bases) (фрагменты Оказаки) 3’ pol I 5’ ДНК полимераза I достраивает фрагмент Оказаки, одновременно удаляя РНК-праймер за счет 5’-3’ экзонуклеазной активности

Основные компоненты репликативной вилки E. Coli + гираза + лигаза

Инициация репликации ДНК на ori. C Белки Dna. A присоединяются к Dna. A боксам в участке начала репликации – Часть участка начала репликации «накручивается на комплекс белков Dna. A. В результате возникшего напряжения плавится А-Т – богатый домен участка начала репликации белок (хеликаза) присоединяется к участку начала репликации

Uses energy from ATP to unwind the duplex DNA Хеликаза начинает раскручивать ДНК в обоих направлениях, создавая возможность сборки двух репликативных комплексов SSB SSB

Репликация ДНК у эукариот Общие черты репликации ДНК у прокариот и эукариот 1. Полуконсервативный синтез ДНК 2. Двунаправленный синтез ДНК 3 Синтез в направлении 5’-3’. Соответственно, хотя бы одна цепь синтезируется в виде фрагментов Оказаки 4. Инициация синтеза ДНК посредством РНК-праймеров

Pol - PRIMASE DNA Pol (I) (primase complex) - bifunctional Heterotetrameric phosphoprotein 48 k. Da PRIMASE- initiates RNA-primer synthesis (makes complementary RNA primer) 58 k. Da protein- tethers primase to 180 k. Da subunit 180 k. Da polymerase A subunit- extends RNA primer 70 k. Da subunit- no known catalytic function (may recruit pol : primase to the replication fork)

У эукариот ДНК полимераза дельта удерживается на ДНК при посредстве PCNA, который состоит из трех субъединиц и выполняет те же функции, что и бета-кольцо у бактерий

Структура бактериального и эукариотического кольцевых факторов процессивности репликативной ДНК полимеразы весьма схожи. Так же, как у прокариот, у эукариот для посадки фактора процессивности на ДНК требуется особая группа вспомогательных белков beta-clump E. Coli (состоит из двух субъединиц) PCNA высших эукариот (состоит из трех субъединиц)

Структура эукариотического комплекса, осуществляющего посадку скользящего зажима похожа на структуру бактериального g комплекса

RFC contains 5 similar subunits that spiral around DNA. The RFC helix tracks the DNA or DNA/RNA helix RFC PCNA DNA: RNA

Процессинг фрагментов Оказаки РНК 7 -14 n ДНК, построенная Pol a (low fidelity) ~ 20 n Это надо удалить и перезастроить ДНК, построенная Pol delta ~200 n

Процессинг фрагментов Оказаки FEN 1 – Flap Endonuclease 1

FEN 1 отрезает довольно короткие куски. Для удаления более длинного Фрагмента необходимо либо многоэтапное последовательное вытеснение ДНК полимеразой и отрезание, либо деградация нуклеазой Dna 2 с Последующим точным отрезанием FEN 1

Компоненты репликационной машины эукариот 1. DNA pol + primase: синтезирует праймеры для синтеза ведущей и отстающей цепей. 2. DNA pol : элонгация отстающей цепи DNA pol e : элонгация ведущей цепи 3. PCNA: (proliferating cell nuclear antigen) фактор процессивности pol 4. Факторы репликации C (RF-C; посадка зажима, ATPase) and RF-A (связывание однонитевой ДНК). 5. Topoisomerases I & II: регулируют топологию ДНК.

E. coli protein Eukaryotic protein Function Dna. A Gyrase ORC proteins Topoisomerase I/II Узнавание ориджина репликации Dna. B Mcm DNA helicase – расплетает родительскую двойную спираль Dna. C SSB Cdc 6, Cdt 1 RPA Загружает хеликазу на ДНК γ-complex RFC pol III core pol δ/ε β clamp Primase ——— PCNA Кольцевой зажим, удерживающий ДНК полимеразы на ДНК Primase pol α Synthesizes RNA primers DNA ligase Сшивает фрагменты Оказаки в непрерывную цепь pol I FEN-1 Удаляет РНК праймеры; У также E. coli pol I заполняет бреши Сбрасывает положительные супервитки веред репликационной вилкой Поддерживает ДНК в одноцепочечном состоянии Субъединицы холоэнзима ДНКполимеразы, которые загружают зажим на ДНК Основные репликативные ферменты; синтезируют всю лидирующую цепь (pol ε) и фрагменты Оказаки (pol δ); Обладают возможностью коррекции ошибок Synthesizes short DNA oligonucleotides as part of RNA–DNA primer

Геном человека кодирует по меньшей мере 15 ДНК полимераз, которые по структурной гомологии можно подразделить на 4 группы: A (Pols γ, ν and θ (Theta)) B (Pols α, δ, ε and ζ) X (Pols β, λ, μ, and terminal deoxyribonucleotidyltransferase) Y (Pols η (eta), ι, κ (σ), and Rev 1) γ репликация митохондриальной ДНК θ (Theta) репликация через апуриновые и апиримидиновые сайты – включение G/C ζ (zeta) репликация через различные повреждения λ, μ участвуют в процессинге концов ДНК в ходе NHEJ η репликация через тимидиновые димеры и G-G димеры, сшитые цис-платином κ (Trf 4/Pol σ ) необходима для соединения (когезии) хроматид

Инициация репликации у эукариот

У млекопитающих размер генома составляет ~2 х10 9 п. н. средняя скорость движения репликативных вилок у эукариот составляет ~ 2 т. п. н. /мин (для сравнения, у E. Coli ~ 60 т. п. н. /мин Таким образом, для репликации всего генома человека одной парой вилок потребовалось бы 1000000 мин = 16600 часов В клетках эукариот одновременно активируется много участков начала репликации Сегмент хромосомы, реплицирующийся с одного участка начала репликации, называется репликоном

Инициация репликации у эукариот Начинается ли репликация в строго определенных участках генома? Основные вопросы Существуют ли специфические последовательности ДНК, служащие местами инициации репликации? Какие белковые факторы участвуют в инициации репликации? Как именно происходит инициация репликации? (последовательность событий)

Bidrectional DNA synthesis Replication forks will merge

Инициация репликации у прокариот. Один ori-сайт

В клетках высших эукариот инициация репликации может происходить где угодно. В эмбриональных клетках (до стадии средней бластулы) и в экстрактах из клеток ксенопуса инициация происходит через короткие интервалы (на молекуле ДНК) и без всякой специфичности в отношении последовательностей. В неэмбриональных клетках сушествуют предпочтительные места инициации, которые могут быть достаточно короткими (репликатор домена бета-глобиновых генов) и достаточно протяженными (зона инициации репликации локуса DHFR) Короткие репликаторы характеризуются наличием ряда необходимых элементов (АТ-богатые последовательности, полупуриновые/полипиримидиновые блоки, изогнутые последовательности ДНК). Набор и сочетание этих элементов могут быть разными в разных репликаторах.

«Тайминг» репликации Replication forks will merge

активные гены обычно являются раннереплицирующимися (реплицируются в начале S фазы) молчащие гены обычно являются позднереплицирующимися (реплицируются в конце S фазы)

В ядре эукариотической клетки репликоны организованы в кластеры После включения в новосинтезированную ДНК бромдезоксиуридина эти кластеры можно увидеть с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания. Распределение активных центров репликации изменяется по ходу S-фазы

В начале S-фазы в клетках присутствует несколько сотен фокусов репликации

* Хромосомы построены из раннереплицирующихся и позднереплицирующихся областей * Минимальный размер раннереплицирующихся и позднереплицирующихся областей составляет 400 -800 Kb, хотя есть и исключения * Раннереплицирующиеся области предпочтительно содержат активные гены и соответствуют R-бэндам, выявляемых при окраске хромосом по Гимза * Позднереплицирующиеся области содержат преимущественно неактивные гены и соответствуют G-бэндам * Разделение хромосом на раннереплицирующиеся области и поздереплицирующиеся области эволюционно консервативно. (хромосомный пэйнтинг)

В анафазе митоза клейзин расщепляется сепаразой, которая становится активной после удаления ингибитора (секурина). Секурин убиквитинилируется при посредстве APC (Anaphase Promoting Complex)