Исследование методом АСМ наноструктур рельефа поверхности клетки

Исследование методом АСМ наноструктур рельефа поверхности клетки

Эритроцит – клетка, чувствительная к изменению осмолярности внеклеточной среды - Увеличение объема при снижении осмолярность - Изменение формы клетки при изменении р. Н Gedde et al. , 1995

Laser interference microscopy in erythrocyte study A. I. Yusipovich, E. Yu. Parshina, N. Yu. Brysgalova, A. R. Brazhe, N. A. Brazhe, A. G. Lomakin, G. G. Levin, and G. V. Maksimov JOURNAL OF APPLIED PHYSICS 105, 102037 (2009) Изменения формы при изменении осмолярности могут быть связаны как с изменение р. Н, так и с изменением вязкости внутриклетокчного содержимого. Однако неизученными остаются тонкие изменения поверхности мембраны при изменении осмолярности

Метод АСМ • Изображение фиксированных глютаровым альдегидом и высушенных на воздухе клеток было получено с помощью метода сканирующей электронной микроскопии на приборе NTEGRA SPECTRA (NT-MDT, Russia). Сканирование производили в полуконтактном режиме с использованием кантилеверов NSG 10 -A, с характерной жесткостью 11. 8 Н/м, радиусом кривизны зонда 10 нм. Сканирование проводили в области 20 x 20 мкм или 1 х1 мкм (256 x 256 точек) (сканирование столиком) при частоте сканирования 0. 5 -1 Гц. Изображения регистрировали при помощи программного обеспечения Nova (NT-MDT, Russia).

Объем, измеренный методом АСМ Определен при помощи гематокрита Определен при помощи АСМ не годится для измерения объема высушенных на воздухе эритроцитов, т. к. их объем уменьшается при высыхании. В то же время сохраняются некоторые характерные изменения формы. Какой параметр можно измерить методом АСМ?

Обработка изображения • Для исследования рельефа поверхности клетки выбирали максимально плоские участки размером 1 мкм 2 на поверхности дискоцита, на каждой клетке исследовали не менее 3 участков, сканирование проводили с разрешением 256*256 точек и частотой сканирования 1 Гц

Видно, что поверхность клетки на микрометровых масштабах имеет значительную кривизну. Для того, чтобы получить более детальное изображение рельефа поверхности мембраны клетки, а также нивелировать артефакты сканирования проводили коррекцию фона, вычитая плоскость полученную путем аппроксимации поверхности полиномом 3 степени. Далее вычитали полученную методом наименьших квадратов константу для каждой сканлинии изображения, убирая перепады между соседними скан-линиями. Выбирали участки без дефектов сканирования, площади контрольной и опытных выборок не отличались

Результат первого этапа обработки изображения Видны колебания рельефа поверхности мембраны с характерными размерами около 300 нм, а также более мелкие глобулярные структуры, средний диаметр которых составляет порядка 50 нм. Для того, чтобы исследовать мелкие изменения структуры поверхности мембраны проводили дополнительную обработку полученного изображения: после предварительного выравнивания (см. выше, первый этап обработки изображения) выполняли низкочастотную Фурье -фильтрацию (high-pass), которая позволяла убрать колебания рельефа с характерными размерами более 150 нм.

Результат второго этапа обработки изображения Видны глобулярные структуры малого размера с диаметром 50± 0. 2 нм (n=35). Подобные особенности поверхности эритроцитов были зафиксированы ранее (Cheng, Liu, 1999; Ohta, Otsuka, 2003), Структуры соответствуют участкам интегральных и примембранных белков, выступающим над поверхностью липидного бислоя (Butt, Wolff, 1990, Zhang, Bai, 1995).

Поверхность мембраны изнутри и снаружи • Характерный размер ячеек цитоскелета Изображение цитоскелета совпадает с характерными размерами эритроцита, регистрация с полученных в настоящей работе внутренней стороны мембраны (масштаб 100 нм) (нефиксированные глобулярных структур на поверхности мембраны, в водном растворе, клетки, что позволяет предположить, что контактный режим) (Swihart, Mikrut, обнаруженные нами структуры могут 2001). ) располагаться в узлах решетки.

• Для характеристики рельефа поверхности удобно использовать интегральный параметр. • Параметр шероховатости (средняя шероховатость, Sa) рассчитывали с помощью программы SPIP 4. 8. 7 по формуле: Sa=3. 39± 0. 04 нм при первом варианте обработки изображения Sa=1. 47± 0. 01 нм – при втором варианте обработки изображения Снижение параметра шероховатости наблюдается после второго варианта обработки изображения (удаления из изображения элементов рельефа с размерами более 150 нм), что свидетельствует о том, что именно они вносят существенный вклад в значение параметра шероховатости.

Рельеф поверхности эритроцитов при изменении осмолярности

Изменение параметра шероховатости при различных значения осмолярности среды инкубации Из рисунка видно, что при первом варианте обработки изображения с повышением осмолярности увеличивается складчатость мембраны с характерными размерами порядка 200 -300 нм, при этом параметр шероховатости поверхности эритроцита увеличивается

Обсуждение результатов • В нативном состоянии мембрана эритроцита подвержена флуктуациям • Интенсивность флуктуаций связана как с изгибным модулем упругости и натяжением мембраны, так и с концентрацией содержимого цитозоля (в случае помещения клеток в гипертоническую среду) (Evans, Gratzer, 2008). По мере увеличения осмолярности амплитуда колебаний увеличивается. Амплитуда флуктуаций изменяется в пределах от единиц до 20 нм. При этом зависимости от содержания в среде АТФ не наблюдается. • Можно предположить, что наблюдаемая при сканировании поверхности эритроцитов методом АСМ складчатость мембраны является «мгновенным снимком» данных флуктуаций, полученным в результате фиксации мембранных белков глютаровым альдегидом.

Дефекты спектрин-актиновго комплекса • Модель флуктуаций мембраны эритроцитов, основанная на образовании дефектов актин-спектриновой сети, вызванных изменением уровня АТФ (Gov, Safrany, 2005). Согласно такой модели образование узла решетки цитоскелета, с которым связаны 5 молекул спектрина вместо 6, вызывает образование выпуклости мембраны, высота которой составляет порядка 2030 нм. Латеральные размеры такой выпуклости составляют порядка 160 -200 нм (Gov, Safrany, 2005) Могут образовываться также множественные дефекты, которые по характерным размерам могут приблизительно соответствовать полученным нами складкам мембраны Флуктуация мембраны, образованная дефектным узлом актин-спектриновго цитоскелета (Gov, Safrany, 2005).

Предположение АТФ (? ) шероховатости (планарная конфигурация мембраны) АТФ осмолярность • шероховатости (образвание дефектных узлов спектрин-актиновой сети) В работе (Pafundo, Alvarez, 2010) показана возможность участия пуринэргических рецепторов в регуляции объема человеческих эритроцитов, при увеличении объема клеток за счет поступления в них воды происходит выброс АТФ (Locovei, Bao, 2006). Можно предположить, что в результате содержание внутриклеточного АТФ снижается, что может оказывать влияние на формирование выступов мембраны по механизму, предложенному в работе (Gov, Safrany, 2005) (наличие планарной конфигурации спектриновой сети при снижении содержании АТФ и образование дефектных узлов спектрин-актиновой сети при увеличении концентрации АТФ).

Выводы • • С помощью метода АСМ визуализирована поверхность эритроцитов человека, имеющая характерные глобулярные структуры, которые могут быть соотнесены с транс- и примемранными белками. Параметр шероховатости, вычисленный с использованием полученных изображений, зависит от условий предварительной обработки изображения – вычитания базовой поверхности, фильтрации методом Фурье-преобразования, что необходимо учитывать, сравнивая результаты различных исследований. Метод АСМ позволяет наблюдать выраженные изменения формы клеток, которые сопровождаются изменениями поверхностной структуры мембраны эритроцитов в растворах различной осмолярности. Увеличение осмолярности среды инкубации приводит к увеличению параметра шероховатости, при этом рельеф мембраны изменяется не за счет увеличения размера малых глобулярных структур, а за счет увеличения структур с характерным размером 200 -300 нм. Выявленные изменения складчатости имеют размеры большие, чем элементарные ячейки спектриновой сети, поэтому их нельзя непосредсвенно ассоциировать с выступами мембраны в узлах цитоскелета. В то же время характерные размеры складчатости указывают на то, что она может являться «мгновенным снимком» динамических флуктуаций мембраны, свойства которых, в свою очередь, могут определяться состоянием цитоскелета. Выяснение роли АТФ в образовании подобной складчатости требует дальнейших исследований.