Использование метода проточной цитофлюориметрии в диагностике

Использование метода проточной цитофлюориметрии в диагностике гемобластозов Толстолуцкая Татьяна Олеговна Ижевская государственная медицинская академия Кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики Ижевск, 2008 г.

ЛЕЙКОЗЫ ОСТРЫЕ ХРОНИЧЕСКИЕ ЛИМФО- МИЕЛО- ЛИМФО- МИЕЛО- бластные пролифера- М 0 тивные М 1 заболевания В- Т- линейные М 2 В-I Т-I М 3 Лейкозы Неходжкинские В-II Т-II М 4 злокачественные В-III Т-III М 5 лимфомы В-IV Т-IV М 6 (лимфосаркомы) М 7

ОСТРЫЕ ЛЕЙКОЗЫ ЛИМФОБЛАСТНЫЕ МИЕЛОБЛАСТНЫЕ (МБЛ) М 0 - острый МБЛ с минимальной миелоидной дифференцировкой бластов М 1 - острый МБЛ без созревания В- Т- М 2 - острый МБЛ с созреванием линейные М 3 - острый промиелоцитарный лейкоз М 3 v – атипичный или гипогранулярный В-I Т-I вариант острого промиелоцитарного лейкоза В-II Т-II М 4 – острый миеломонобластный лейкоз В-III Т-III М 4 эоз – острый миеломонобластный лейкоз с В-IV Т-IV эозинофилией М 5 а – острый монобластный лейкоз без созревания М 5 в – острый монобластный лейкоз с созреванием М 6 – острый эритромиелоз М 7 – острый мегакариобластный лейкоз

FAB Klassifikation der AML

Классификация острых миелолейкозов ВОЗ 2001

Kостный мозг. FISH – флуоресцентная in situ гибридизация

Использование метода проточной цитофлюориметрии в диагностике гемобластозов Толстолуцкая Татьяна Олеговна Ижевская государственная медицинская академия Кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики Ижевск, 2008 г.

Принцип метода СD (кластеры дифференцировки) – это антигены и рецепторы на поверхности клеток, совокупность которых отражает фенотип клетки и позволяет установить ее линейную принадлежность, стадию дифференцировки, метаболическую и пролиферативную активность.

Workshops on Human Leukocyte Differentiation Antigens Summary of the HLDA Workshops I-VIII, 1982 -2004 Workshop CDs assigned Number of CDs assigned I Paris 1982 CD 1 -CDw 15 II Boston 1984 CD 16 -CDw 26 11 III Oxford 1987 CD 27 -CD 45 19 IV Vienna 1989 CD 46 -CDw 78 33 V Boston 1993 CD 79 -CDw 109 31 VI Kobe 1996 CD 110 -CD 166 55 VII Harrogate 2000 CD 167 -CD 247 81 VIII Adelaide 2004 CD 248 -CD 339 93 HLDA → HCDM = "Human Cell Differentiation Molecules”

Оценка иммунологического фенотипа нормальных и опухолевых клеток может проводится различными методами: - реакцией иммунофлюоресценции - иммуногистохимией - иммуноцитохимией - лазерной проточной цитофлюориметрией

Преимущества метода лазерной проточной цитофлюориметрии - исследование большого количества клеток (более 10 000 клеток в 1 секунду) - мониторинг минимальной резидуальной болезни в стадии ремиссии - одновременное изучение нескольких антигенных структур на одной клетке - количественная оценка экспрессии антигена - исследование клеточного цикла и изучение анеуплоидных клеток

Материалом для исследования может быть любая взвесь клеток: - кровь - костный мозг - ликвор - плевральная, асцитическая жидкость - ткань лимфоузла, селезенки - клетки солидных опухолей после предварительной обработки

В основе проточной цитофлюориметрии лежит проведение фотометрических и флюоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света.

ПРОТОЧНЫЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТР FACSCanto II

Лазерный проточный цитометр – источник данных Электроника Гидравлика Оптика детекции P 5 Компьютер FL 2 PE P 4 FL 1 FITC P 3 Лазеры SSC P 2 FSC P 1 28

Проточная цитофлюориметрия Фотометрические каналы используются для оценки размера клеток (прямое светорассеивание – FS) и внутри- клеточных структур (боковое светорассеивание – SS)

Параметры светорассеяния позволяют произвести анализ в определенном гейте – клеточной популяции с заданными характеристиками ( «регион интересов» ).

Флюоресцентные каналы используются для изучения клеточных маркеров (CD) с помощью моноклональных антител, меченных различными флюорохромными красителями к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток

T-хелперы 1 2 CD 3+CD 4+ СD 4 PE 3 4 CD 3 FITC

ЛЕЙКОЗЫ ОСТРЫЕ ХРОНИЧЕСКИЕ ЛИМФО- МИЕЛО- ЛИМФО- МИЕЛО- бластные пролифера- М 0 тивные М 1 заболевания В- Т- линейные М 2 В-I Т-I М 3 Лейкозы Неходжкинские В-II Т-II М 4 злокачественные В-III Т-III М 5 лимфомы В-IV Т-IV М 6 (лимфосаркомы) М 7

Проточная цитофлуориметрия ? Хронический Наблюдай и лимфолейкоз? жди? Лимфома зоны Хлорамбуцил? мантии? Флударабин? Фолликулярная Мабтера? лимфома? Кэмпас? Лимфома Удаление маргинальной селезенки? зоны селезенки? Полихимиоте Лейкоцитоз рапия CHOP? Абсолютный Т – клеточная лимфома? лимфоцитоз

Определение клональности В-ЛПЗ Поликлональна пролиферация В-лимфоцитов Моноклональная пролиферация В-лимфоцитов

В пунктате КМ бластные клетки составляют 88, 2%, представлены преимущественно мезоформами с умеренным ядерно-цитоплазматическим соотношением и слабой базофилией цитоплазмы. Форма ядер в основном округлая, структура хроматина нежная. Зернистость не определяется. МПО и липиды отрицательные, PAS-положительное вещество в гранулярной форме в единичных бластных клетках. Установление морфоцитохимического варианта острого лейкоза затруднено. При иммунофенотипировании КМ выявлен фенотип бластных клеток: CD 34+, HLA-DR+, CD 13+, CD 33+, CD 7+ Заключение: иммунофенотип бластных клеток соответствует М 0 варианту ОМЛ с коэкспрессией Т- клеточного антигена CD 7, что отражает неблагоприятный прогноз заболевания.

Определение количества стволовых кроветворны х клеток методом проточной цуитофлуори -метрии

Клиническое значение иммунофенотипизирования на примере ОЛЛ Multizentrische Therapieoptimierungsstudie der akuten lymphatischen Leukämie bei Erwachsenen und Adoleszenten ab 15 Jahren GMALL 07/2003 (Hoelzer-Protokoll) Иммунофенотипические критерии:

Бифенотипические острые лейкозы Points B lymphoid T lymphoid myeloid * * May be expressed in some cases of precursor T lymphoblastic leukaemia/lymphoma European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL) Leukemia (1995) 9, 1783 -1786 Brunning et al. Acute leukaemias of ambigous lineage. WHO Classification of Tumours: Tumours of Hematopietic and lymphoid tissues. 2001

ЭРИТРЕМИЯ

Лимфопролиферативные заболевания В-клеточные опухоли Т- и НК-клеточные опухоли Из предшест- Из зрелых венников (периферических) В-клеток Т-клеток

В-клеточные опухоли лимфоидной ткани Из предшественников В-клеток В-лимфобластная лимфома/лейкоз из клеток-предшественников В-клеточные опухоли из зрелых (периферических) клеток: В-клеточный ХЛЛ/лимфома из малых лимфоцитов В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз Лимфоплазмоцитарная лимфома Лимфома маргинальной зоны селезенки Волосатоклеточный лейкоз Плазмоклеточная миелома/плазмоцитома Нодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны MALT-лимфома Фолликулярная лимфома Лимфома из клеток мантийной зоны Диффузная крупноклеточная лимфома Лимфома/лейкоз Беркитта

Определение клональности В-ЛПЗ Поликлональна пролиферация В-лимфоцитов Моноклональная пролиферация В-лимфоцитов

Хронический лимфолейкоз/лимфома из малых лимфоцитов Абсолютный лимфоцитоз в периферической крови > 5000 в 1 мкл Пролимфоциты <10% Лимфоцитоз в костном мозге > 30% Моноклональная пролиферация лимфоцитов с фенотипом СD 19+, CD 5+, CD 23+, CD 79 a, рестрикция легких цепей ( либо ) и низкой плотностью поверхностных иммуноглобулинов Цитогенетика: в 1/3 случаев - трисомия 12(ассоциируется с более агрессивным клиническим течением). У 25% - структурные нарушения в 13 хромосоме.

ХЛЛ CD 19 +CD 5+CD 23+CD 20+

Прогностические маркеры CD 38 - экспрессия CD 38 при ХЛЛ на более 20% опухолевых клеток коррелирует с более короткой выживаемостью больных ZAP-70 (70 -k. D zeta - associated protein) суррогатный маркер мутационного статуса вариабельных участков генов ИГ. Экспрессия выявлена при ХЛЛ без мутаций и ассоциируется с плохим прогнозом.

Динамика течения ХЛЛ в зависимости число от числа опухолевых клеток опухолевых клеток лечение 1013 ---- постановка ------ диагноза 1012 ------ * ------ ** ------ ремиссия 1010 **** ------ ***** ------ ****** минимальная ******* ------ остаточная 108 ******* ------ ******* болезнь ******* ------ норма Определение прогностических Ранняя диагностика маркеров и тактики ведения и диф. диагностика больных (CD 38, ZAP 70)

Фолликулярная лимфома Группа лимфоидных опухолей, происходящих из светлых центров размножения фолликулов (центроцитов/центробластов) Составляет от 30 -40% всех лимфоидных опухолей, средний возраст больных– 59 лет. Опухолевый аналог-В-лимфоцит из фолликулярного центра Соматические Ig. VH мутации Критическим молекулярным событием в патогенезе фолликулярной лимфомы является транслокация t(14; 18) (в 80 -90% случаях) с высокой конститутивной экспрессией BCL-2, что обеспечивает преимущество в выживании опухолевых клеток и ингибицию апоптоза

В периферической крови: лейкоцитоз, анемия и/или тромбоцитопения, абсолютный лимфоцитоз. Среди лимфоцитов преобладают клетки средних размеров с высоким ядерно- цитоплазматическим соотношением, ядром неправильной формы, с глубокими расщелинами, зазубринами, расщепленными ядрами. Цитоплазма окружает ядро узким ободком светло- голубого цвета Иммунофенотип s. Ig+, CD 19+, CD 20+, CD 22+, CD 79 a+, CD 10+, рестрикция легких цепей ( либо ) Цитогенетика t(14; 18) Онкогены сверхэкспрессия BCL 2

Лимфома из клеток мантийной зоны Составляет 6% всех злокачественных неходжкинских лимфом Опухолевый субстрат –наивный В-лимфоцит зоны мантии (CD 19+CD 5+CD 23 -) Наиболее характерные клинические признаки: генерализованная лимфаденопатия, поражение печени, селезенки, костного мозга (в 50 -82% наблюдений). Три цитологических варианта (мелкоклеточный, полиморфноклеточный, бластоидный)

Лейкемическая фаза лимфомы из клеток мантийной зоны Морфология опухолевых клеток – средний размер с ядром неправильной формы, расщепленным или вдавленным. Ядрышки нечеткие. Иммунофенотип CD 5++, CD 19++, CD 20+++, CD 43+, CD 10 -, CD 23 -

Иммунофенотип опухолевых клеток: CD 19+CD 5+CD 20+(высокая экспрессия)CD 23 - CD 5/CD 19 -позитивные клетки - 45, 0%; CD 20 -позитивные клетки - 56%; CD 22 -позитивные клетки - 57%; CD 19 -позитивные клетки -70, 0%.

Лейкемическая фаза лимфомы из клеток мантийной зоны(бластоидный вариант) Морфология клеток не отличается от лимфобластов

Иммунофенотип опухолевых клеток: CD 19 +CD 5+ CD 20+CD 23 -CD 22+ CD 10 - CD 5/CD 19 -позитивные клетки - 65, 2%; CD 20 -позитивные клетки - 80, 5%; CD 22 -позитивные клетки - 50, 7%; CD 19 -позитивные клетки - 85, 2%, Ki 67 -позитивные клетки - 41, 3%.

Лимфомы маргинальной зоны Экстранодальная Нодальная лимфома MALT-типа Лимфома селезенки Опухолевый субстрат – моноцитоидные В-клетки

Морфология лимфоцитов

иммунофенотип лимфоцитов периферической крови : CD 19 +, CD 5 -, CD 20+, CD 23 - CD 5/CD 19 -позитивные клетки -0, 5%; CD 20 -позитивные клетки - 60%; CD 19 -позитивные клетки - 52, 0%.

CD 19 CD 10 CD 23 CD 5 Хронический ++ - + + + лимфолейкоз Фолликулярная ++ + ++ - - лимфома Лимфома из ++ - + клеток мантийной зоны Лимфома ++ - - маргинальной зоны

ПАРАПРОТЕИНЕМИЯ ИММУНОФИКСАЦИ Я BECKMAN 2001

ПАРАПРОТЕИНЕМИЯ - динамика BECKMAN 2001

БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!Благодарю за внимание!