Использование больших нейтральных аминокислот Neo Phe в лечении

Использование больших нейтральных аминокислот (Neo. Phe) в лечении детей с ФКУ (двойное слепое плацебо контролируемое исследование) Проф. П. В. Новиков (Россия) Р. Маталон, К. М-Маталон, Д. Грейди, С. Тайринг (США) А. Бурлина, М. Джованнини, Л. Фиори (Италия), Ф. Гаттлер (Дания) Е. Я. Гречанина (Украина) К. Брага (Бразилия)

Большие Нейтральные Аминокислоты (LNAA) • Фенилаланин (Phe) • Лейцин • Тирозин • Триптофан • Метионин • Гистидин • Изолейцин • Валин • Треонин

Транспорт LNAA в мозг Km ммоль/L Km app • • • Фенилаланин (Phe) Лейцин Тирозин Триптофан Метионин Гистидин Изолейцин Валин Треонин 0. 12 0. 15 0. 16 0. 19 0. 28 0. 33 0. 63 0. 73 Пардридж, Врожденное нарушение обмена у людей. MTP Press, 1980. 0. 45 0. 53 0. 58 0. 71 0. 77 1. 10 1. 30 2. 50 3. 00

Andersen AE, Avins L • LNAA вводилась крысятам • Гидроксилаза фенилаланина ингибировалась парахлорфенилаланином • Фенилаланин мозга понижался 1976 Arch Neurology 33: 684

Тирозин при лечении фенилкетонурии Лу и др. назначали Tyr 160 мг/кг пациентам с фенилкетонурией • Возрос объем внимания • Увеличился синтез допамина 1987 Acta Paediatr Scand 76: 560

Тирозин при лечении фенилкетонурии • Пьетц и др. назначали высокую дозу тирозина взрослым • с фенилкетонурией и высоким содержанием Phe в крови Никакой разницы по сравнению с плацебо в проходящей лечение группе обнаружено не было 1995 J Pediatr 127: 936

Триптофан при лечении фенилкетонурии • Нильсен и др. применяли триптофан по 4, 5 • г/день пациентам с фенилкетонурией в течение 3 недель Обнаружено 3 -кратное увеличение 5 -HIAA в ликворе, несмотря на высокое содержание в крови Phe 1988 Dietary Phenylalanine and Brain Function. Birkhauser

VIL при лечении фенилкетонурии • В 1990 году Берри и др. использовали VIL (валин 150 мг/кг, изолейцин 150 мг/кг и лейцин 200 мг/кг) для снижения поступления phe в мозг • Обнаружено существенное снижение Phe в ликворе • Тирозин в ликворе также был существенно снижен Am J Dis Child 144: 539

Добаление LNAA при фенилкетонурии • Дотремо и др. использовали LNAA и • • низкопротеиновую диету по 0, 6 г/кг у 4 пациентов с фенилкетонурией Через 1 месяц у испытуемых был обнаружен отрицательный азотный баланс Лизин лимитировал аминокислоту 1995 J Inherit Metab Dis 18: 127

Добавление LNAA при фенилкетонурии • Пьетц и др. 6 мужчинам с фенилкетонурией давали дозу (100 мг/кг Phe) с и без LNAA • МРС показала ограничение поступления Phe в мозг • С LNAA - ЭЭГ нормальная • Без LNAA – ЭЭГ замедленная • Radiology 1996, 201: 413

Km (app) – Km (1 + ∑[aa]/Km] Это предполагает, что, если уровень плазмы LNAA намного ниже его величины Km, то эта аминокислота не будет эффективно конкурировать за белок-носитель

Абсолютные и эффективные величины Km нейтральных аминокислот для нейтрального аминокислотного транспортера в BBB (Партридж, 1980) Аминокислота Типичный Km App Km уровень (м. M) плазмы (м. M) LNAA’s Phe Leu Tyr Trp Met Isoleu Val Thr 0. 05 0. 10 0. 09 0. 10 0. 04 0. 07 0. 14 0. 19 0. 12 0. 15 0. 16 0. 19 0. 33 0. 63 0. 73 0. 45 0. 53 0. 58 0. 71 0. 77 1. 3 2. 5 3. 0

Абсолютные и эффективные величины Km нейтральных аминокислот для нейтрального аминокислотного транспортера в BBB (Партридж, 1980) Аминокислота Типичный уровень Исх. пол. aa плазмы (м. M) Km (м. М) App Km (м. М) His Arg 0. 05 0. 10 0. 28 0. 09 1. 1 0. 40 Lys 0. 30 0. 10 0. 25

Транспорт LNAA через слизистую оболочку кишечника Km ммоль/L • Фенилаланин 1. 0 • Лейцин 2. 0 • Валин 3. 0 • Метионин 5. 0 • Гистидин 6. 0 • Эффект конкуренции, как правило, не наблюдается в ткани помимо мозга, если не используется высокая концентрация аминокислот Pardridge, Inborn Errors of Metabolism in Humans. MTP Press, 1980.

Ингибирование аминокислотой транспорта Phe в Како-2 -клеточном – 10 u. M Phe в буферном растворе, примененном к монослоям в присутствии 1 м. М концентрации каждой аминокислоты Ингибитор % ингибирование LNAA’s Leu 55% Tyr 45% Trp 36% Исходное положение aa Lys 50% His 33% Hidalgo Biochem Biophys. Acta 1008: 5 -30 a (1990)

Генотип мышей ENU 2 (F 263 S) N HET HOMO

LNAA при лечении мышей с фенилкетонурией • Мыши ENU 2/ENU 2 с фенилкетонурией • Содержание в крови phe и tyr до лечения • LNAA, представленная в форме Pre. KUnil • Доза 0. 5 г/кг или 1. 0 г/кг • Phe и tyr в крови до 6 недель после лечения

Мыши с фенилкетонурией на Neo. Phe phe мг/дл Мыши Контрольные на Neo. Phe 78 - 80 - 83 - 86 - 159 - 162 - F 577 23. 8 21. 4 19. 4 24. 9 18 11 F 579 23. 7 25. 1 28. 4 33. 1 8. 3 14. 8 F 582 28. 8 21. 9 22. 2 20. 9 10. 3 8. 3 F 584 23. 8 30. 7 7. 8 12. 4 30 25. 3

Мыши с фенилкетонурией на Neo. Phe phe мг/дл Контрольные на Neo. Phe Мыши 78 - 80 - 83 - 86 - F 585 20. 6 21. 7 24. 4 19. 8 8. 5 12. 3 F 586 23. 2 25. 7 21. 2 21. 9 13. 5 11. 3 F 588 21. 6 21. 7 24. 2 24. 4 10. 9 Ср. в кажд. точке вр. 23. 6 23. 9 23. 6 25. 1 11 11. 6 Ср. для всех До-LNAA 24. 1 Ср. для всех Пост. LNAA 11. 3 159 - 162 -

Клинические испытания эффективности Neo. Phe у пациентов с фенилкетонурией c помощью дважды слепого контроля плацебо в США

Рис 1. Реакция Phe в крови на 0, 5 г/кг Neo. Phe у пациентов с фенилкетонурией 2000 1800 1600 IVS 12 nt 1 g>a/R 261 Q IVS 12 nt 1 g>a/Y 356 X IVS 12 ntg>a/IVS 10 nt 11 g>a E 280 K/R 408 W IVS 12 nt 1 g>a/IVS 12 nt 1 g>a R 261 Q/R 408 W/R 408 W IVS 4 ntg>t/R 408 W/R 408 W E 280 K/E 280 K F 299 C/IVS 12 nt 1 g>a I 65 T/R 408 W F 299 C/unk uмоль/л 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Нулевое время Phe в крови 1 неделя Парный t-тест: p=0. 001

Рис. 2. Реакция Phe в крови на 1. 0 г/кг Neo. Phe у пациентов с фенилкетонурией 1800 1600 uмоль/л 1400 1200 IVS 12 nt 1 g>a/R 261 Q IVS 12 nt 1 g>a/Y 356 X IVS 12 nt 1 g>a/IVS 10 nt 11 g>a E 280 K/R 408 W IVS 12 nt 1 g>a/IVS 12 nt 1 g>a не определено R 408 W/R 252 W 1000 800 600 400 200 0 Нулевое время Phe в крови 1 неделя Парный t-тест: p=0. 006

Дважды слепой контроль плацебо на пациентах в США • Пациенты были генотипированы • Начальный фенилаланин определялся 3 раза • Плацебо или Neophe вводились в течение одной недели по 1 таблетке/кг/день • Phe в крови определялся 3 раза

E 280 K/E 280 K мг/дл ммоль/л до Neophe ноль 1 26. 1 1566 ноль 2 29. 36 1761 ноль 3 27. 2 1632 Neophe 24 часа 16. 04 962 72 часа 16 960 96 часа 8. 4 504 1 неделя 8. 8 528 Плацебо 24 часа 72 часа 96 часов 1 неделя 21. 2 24. 1 23. 6 22. 5 1272 1446 1416 1350

299 C/IVS 12 nt 1 g>a мг/дл До Neophe ноль 1 25. 6 1536 ноль 2 32. 9 1974 ноль 3 26. 8 1608 Neophe 24 часа 14. 3 858 72 часа 16. 8 1008 96 часов 18. 1 1086 1 неделя 12. 2 732 Плацебо 24 часа 72 часа 96 часов 1 неделя 19. 2 20. 6 24. 8 23. 7 1152 1236 1488 1422 ммоль/л

F 299 C/- До Neophe ноль 1 16. 09 965. 4 ноль 2 18. 1 1086 ноль 3 17. 2 1032 Neo. Phe 24 часа 12 720 72 часа 14. 1 846 96 часов 10. 1 606 1 неделя 11. 4 684 Плацебо 24 часа 72 часа 96 часов 1 неделя 16. 2 18. 2 17. 1 16. 12 972 1092 1026 967. 2 мг/дл ммоль/л

I 65 T/R 408 W мг/дл До Neophe ноль 1 24. 1 1446 ноль 2 23. 0 1380 ноль 3 21. 1 1266 Neophe 24 часа 12. 8 768 72 часа 11. 2 672 96 часов 12. 9 774 1 неделя 13. 5 810 Плацебо 24 часа 72 часа 96 часов 1 неделя 18. 2 22. 2 19. 1 22. 3 1092 1332 1146 1339 ммоль/л

Сводная таблица среднего Phe в крови ноль µмоль/ Neo. Phe л µмоль/л Плацебо µмоль/л E 280 K/E 280 K 1653 738. 5 1350 F 299 C/IVS 12 ntgl>a 1706 921 1422 1027. 8 712 967. 2 1364 752 1339. 2 F 299 C/- I 65 T/R 408 W

микромоль/л Сводный график двойного слепого исследования в США 1800 1600 1400 1200 1000 E 280 K/E 280 K F 299 C/IVS 12 ntg 1>a 800 600 400 200 0 F 299 C/I 65 T/R 408 W ноль 1 неделя 2 недели На Neo Phe Плацебо

Вывод • LNAA может снижать уровни Phe в крови при добавлении ее в пищу • Необходимы более длительные исследо- вания дважды слепого контроля плацебо • Установление эффективности и безопас- ности LNAA может улучшить результаты лечения фенилкетонурии

Двойное слепое исследование в других Центрах • Бразилия • Россия • Украина • Италия

ОПЫТ, ПОЛУЧЕННЫЙ В БРАЗИЛИ Apae-Rio ПРИ ПОМОЩИ КРУПНЫХ НЕЙТРАЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТ Клаудиа Брага 1, 2, Армандо Фонсека 1, 2, Мариа де Фатима Сантос де Оливейра 1, Мариа Хелена Тоссман 1, Мариа Целиа Аппель1, Эдуардо Виэйра Нето 2 Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE-Rio)1 Diagnósticos Laboratoriais Especializados (DLE)2 Рио-де-Жанейро, Бразилия

Методы Мы исследовали трех пациентов (1 мужчину и 2 женщин), в возрасте между 13 и 14 годами, двойным слепым методом, в течение четырех недель по следующему протоколу: q 1 -ая неделя: особая диета (смесь аминокислот) q 2 -ая неделя: особая диета и плацебо или Neo. Phe (1 таблетка/кг) q 3 -ья неделя: особая диета q 4 -я неделя: особая диета и плацебо или Neo. Phe Концентрации фенилкетонурии определялись три раза в неделю в течение всех недель посредством ферментного колориметрического метода (Neo. LISA PKU Kit- Intercientífica) в двух экземплярах. У всех аминокислот также определялась тандемная масс-спектрометрия на пятый день каждой недели. У одного пациента (случай 3) появились рвоты на четвертой

Случай 1. RSL Фенилкетонурия мг% Ферментный методd 14 12 10 8 день 1 день 3 день 5 6 4 2 0 неделя 1 Фенилкетонурия в среднем 11, 7 мг% неделя 2 неделя 3 неделя 4 плацебо интервал Neo. Phe 7, 95 мг% 8, 48 мг% 6, 5 мг%

Случай 1. Фенилаланин Тандемная масс-спектрометрия 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 44, 5 % Фенилкетонурия мкмоль/л неделя 1 неделя 2 неделя 3 неделя 4 плацебо интервал Neo. Phe

Случай 1. Тирозин Тандемная масс-спектрометрия 70 60 50 40 30 Tyr мкмоль/л 20 10 0 неделя 1 неделя 2 неделя 3 неделя 4 плацебо интервал Neo. Phe

Ферментный метод Фенилкетонурия мг% Случай 2. TSA 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 32% день 1 день 3 день 5 неделя 1 Фенилкетонурия в среднем 6, 9 мг% неделя 2 Neo. Phe 4, 7 мг% неделя 3 неделя 4 интервал плацебо 6, 5 мг% 7, 46 мг%

Случай 2. Фенилаланин Тандемная масс-спектрометрия 700 600 500 400 300 Фенилкетонурия мкмоль/л 200 100 0 неделя 1 Неделя 2 неделя 3 неделя 4 Neo. Phe интервал плацебо

Случай 2. Тирозин Тандемная масс-спектрометрия 160 140 120 100 80 Tyr мкмоль/л 60 40 20 0 неделя 1 неделя 2 неделя 3 неделя 4 Neo. Phe интервал плацебо

“Опыт, полученный в России с крупными нейтральными аминокислотами” Петр Новиков Московский научноисследовательский институт педиатрии и детской хирургии, Россия, г. Москва

Характеристика больных ФКУ • • Количество больных ФКУ – 6 Возраст 8 -14 лет Пол М: Д=1: 1 Масса тела от 21 -45 кг Генотипы больных - R 408 W/ R 408 W Возраст диагностики заболевания – от 3 мес до 3 г 6 мес Начальные уровни ФЕН 18 -20; 11 -16 -20 мг% 16 -20 - 17 -20 мг%

Характеристика больных ФКУ • • ЦНС - УО тяжелой степени - 3 - УО умеренной степени - 2 - УО- парциальная - 1 Показатели крови: Общий белок крови – 68 -73, 2 г% Альбумин – 46 -58 % Эритроциты – 3, 84 -4, 72 - x 10 12 Лейкоциты 5, 7 -6, 9 - x 10 9 9

Протокол исследования Neo. Phe (LNAA) и Placebo • Цель: доказать возможность снижения ФЕН в крови • 1. Больные ФКУ находились на обычной их диете • 2. Период исследования – 3 недели • 3. 1 -я неделя Начальная доза 1 табл. /кг(0, 5 г аминокислот) (Placebo and Neo. Phe) на 3 приема с пищей (прием Neo. Phe с пищей обязателен!) • 4. Забор крови на ФЕН и ТИР: 0 период, через 24 часа после первой дозы Neo. Phe или Placebo, затем 2 -й и 4 -й

(Продолжение) • 5. 2 -я неделя – Без приема Neo. Phe и Placebo Забор крови на ФЕН и Тир 1 -2 разе • 6. 3 -я неделя – 1 табл. /кг (0, 5 г аминокислот) Neo. Phe or Placebo в 3 приема с пищей. • 7. Забор крови на ФЕН и ТИР: 0 период, через 24 часа после первой дозы Neo. Phe или Placebo, затем 2 -й и 4 -й дни

The formula for treating PKU • Для лечения больных ФКУ использовались • • • продукты, лишенные фенилаланина (для возраста свыше 6 лет), содержащих следующие ингредиенты: Белок - 70, 0/ 100 г, ФЕН – 0, Липиды – 0, Углеводы– 0, Энергия - 280, 0 ккал/100 г В качестве дополнительных продуктов специальные продукты, лишенные белка (безбелковый хлеб, макароны, саго, пирожные и др. ), на основе крахмала

Формула для лечения ФКУ • Толерантность к Фен за 24 часа для детей в возрасте 6 -11 лет – 20 -15 мг/кг за 24 часа, старше 11 лет– 15 -10 мг/кг массы тела • Забор крови на ФЕН у больных ФКУ проводился, как правило, в утренние часы • Все больные оставались на той же диете до Neo. Phe и после того, как включался Neo. Phe

Методы исследования • Молекулярно-генетический анализ • • (выявление типов мутаций) Биохимический метод исследования аминокислот: Тандемная хромато-масс-спектрометрия • Метод Флюорометрии

Результаты исследований уровней Phe and Tyr • Прием Placebo/ 1 -я неделя LNAA 0 –период 2 -й день 4 -й день Phe Tyr Placebo 8, 04 0, 4 7, 79 0, 35 9, 93 0, 56 Тандем. ХМС 8, 64 0, 46 7, 81 0, 41 8, 96 0, 56 Флюорометрия 9, 7 9, 3 12, 6 Прием LNAA (Neo. Phe) Тандем. ХМС 8, 27 0, 68 8, 64 0, 98 9, 61 0, 75 6, 62 0, 91 8, 47 0, 83 7, 68 0, 64 Флюорометрия 10, 0 10, 4 12, 4 9, 1 10, 1 9, 0 8, 64 0, 46 7, 81 0, 41 8, 96 0, 56

Результаты исследований уровней Phe and Tyr • Placebo/ LNАА 2 -я неделя (без приема) 2 -й день Phe Tyr Тандемная. ХМС 9, 04 – 0, 436, 7 0, 72 Флюорометрия 12, 08, 2 4 -й день Phe Tyr 9, 43 - 0, 666, 89 0, 54 11, 2 8, 6

Результаты исследований уровней Phe and Tyr • Placebo/ LNAA (Neo. Phe) день 3 -я неделя 0 -период Phe Tyr 2 -й день Phe Tyr 4 -й Phe Tyr Placebo Тандемная ХМС Флюорометрия 7, 86 0, 63 7, 25 1, 03 6, 88 0, 86 6, 62 0, 91 8, 47 0, 83 7, 68 0, 64 10, 6 8, 98 0, 48 9, 7 7, 97 0, 42 9, 4 8, 93 0, 52 Прием LNAA(Neo. Phe) Тандемная ХМС 10, 04 1, 86 7, 26 1, 02 Флюорометрия 11, 0 8, 5 9, 4 8, 0 5, 57 0, 41 6, 9

Динамика уровня ФЕН у больных с ФКУ при использовании Neo. Phe на 3 -й неделе исследования (иллюстрация) 3 -я неделя • 1 -й больной ФКУ: 1 -й день 10, 4 мг%, 2 -й день – 7, 26 мг% и 4 -й день – 5, 57 мг% • 2 -й больной ФКУ: ФЕН - 8, 5 , 2 -й день - 8, 0 и 4 -й день - 6, 9 мг%

Российское исследование LNAA Время Phe Tyr KH µмоль/l мг/дл 0’ 635. 4 10. 59 33. 0 0. 60 3 дня 554. 4 9. 24 242. 0 4. 40 3 дня 322. 2 5. 37 94. 6 1. 72 3 дня 136. 2 2. 27 110. 0 2. 00 3 дня 102. 6 1. 71 94. 0 1. 71

Российское исследование LNAA Время KN 0’ 3 дня e Ph µмоль/ л 707. 4 607. 2 572. 4 585. 6 Tyr мг/дл 11. 79 10. 12 9. 54 9. 76 µмоль/ л 42. 9 126. 5 159. 5 83. 6 мг/дл 0. 78 2. 30 2. 91 1. 52

Российское исследование LNAA Время KA Phe Tyr мг/дл 0’ 3 дня µмоль/ л 718. 8 668. 4 мг/дл 11. 98 11. 14 µмоль/ л 53. 9 91. 3 3 дня 523. 2 376. 2 8. 72 6. 27 103. 4 108. 3 1. 88 1. 97 0. 98 1. 66

еакция уровней Phe у пациентов с фенилкетонурией при введении Neo. Phe (Россия) Паци- Воз. Пол ент раст Генотип Средние Phe Уровни Phe Снижение Уровни Phe (µмоль/л) уровней (µмоль/л) уровни Phe в после (µмоль/л) после Neo. Phe крови (%) Плацебо до Neo. Phe 1 Ж R 408 W/ R 252 W 1261, 19 782, 6 37, 9 - 2 12 M Не определен 1264, 2 626, 08 50, 5 - 3 11 Ж R 408 W / R 408 W 1023, 4 692, 3 32, 4 - 4 12 Ж R 408 W / R 408 W 1023, 4 662, 2 35, 3 903 5 19 Ж R 261 X/R 408 W 1143, 8 933, 1 * 18, 4 - Сред нее s 22 15, 2 1143, 19 739, 29 35, 3 903 * - Пациент прекратил получение Neo. Phe из-за осложнений, которые возникли у девочки

Выводы ► 1. LNAA (Neo. Phe) могут снижать уровень фенилаланина в крови у больных с классической ФКУ ► 2. Снижение уровня фенилаланина сопровождается повышением уровня тирозина в крови ► 3. Степень снижения фенилаланина в крови может быть высокой после короткого периода отмены LNAA ► 4. Необходимо продолжать исследования по проверке гипотез о положительном эффекте больших нейтральных аминокислот LNAA у больных с ФКУ

Исследование двойного слепого плацебо в Украине Елена Гречанина и Ирина Новикова Харьковский университет, Украина

Реакция на Neo. Phe : Двойное слепое исследование, Украина 1400 ммоль/л 1200 1000 R 408 W/ R 252 W 800 Не определена R 408 W / R 408 W 600 R 408 W / R 408 W 400 R 261 X/R 408 W 200 0 До Neo. Phe После Neo. Phe концентрация phe в крови Реакция Phe в крови на 0, 5 г/кг Neo. Phe у 5 пациентов с фенилкетонурией

Крупные нейтральные аминокислоты – новый вид лечения фенилкетонурии Марчелло Джованнини, Лаура Фиори Отделение педиатрии, Госпиталь Сан-Пауло, Миланский университет, Италия

LNAA Неделя 1, на капс. (phe мг% - мк. M/л) Базально Неделя 2, (без капс. ) Ж, возраст 29 Неделя 3, на капс. (phe мг% - мк. M/л) 16. 7 - 984 - 18. 3 - 1098 16. 4 – 984 - 11. 9 – 714 - 13. 4 - 804 12. 7 - 762 - 15 - 900 22% 18% (max 34%) 12. 9 – 774 Конец недели Снижение phe в пл. % LNAA: 1/кг веса 14. 9 - 894 14. 4 – 864 Вес: 49 кг. R 158 Q / -

Исследование Neo. Phe-Плацебо в Италии, г. Падуя Алессандра Бурлина и Альберто Бурлина

Реакция на Neo. Phe: двойное слепое исследование Пациент Возраст Исх. уровень Neo. Phe Плацебо % снижения MC 26 1004 787. 3 937. 5 21. 58 NV 15 597 157 554 73. 70 BL 21 926 1225 AL 20 1067 1375

Выводы • LNAA могут снижать уровни Phe в крови у пациентов с классической фенилкетонурией • Снижение уровней Phe в крови сопровождается повышением в крови уровней Tyr • Степень снижения уровней Phe может быть выше после короткого периода без LNAA • В будущем необходимо проверить различные гипотезы воздействия LNAA

Признательность • Данное исследование частично опиралось на гранты Средне- Атлантического Объединения по вопросам фенилкетонурии и связанных с ней заболеваний (MACPAD) и Южно-Техасской Ассоциации по вопросам фенилкетонурии и связанных с ней заболеваний (STAPAD) • Щедрое количество Neo. Phe было предоставлено компанией Прекулаб, Дания • Благодарим все Центры в Бразилии, Италии, Украине и России за их участие в исследовании

Спасибо за внимание