Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН (Оренбург) МИКРОБНАЯ ЭКОЛОГИЯ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА. ДИСБИОЗЫ КИШЕЧНИКА А. В. Валышев Оренбург, Ор. ГМА, 28. 09 -2. 10. 2009 г.

Essais optimistes (Paris, 1907)

И. И. Мечников «Этюды оптимизма» • «Кишечные микробы наиболее многочисленны в толстой кишке. Этот орган, бесспорно полезный у млекопитающих, … совершенно бесполезен для человека» • «… преждевременная и болезненная старость зависит от отравления наших тканей ядами, идущими главным образом из наших кишок и вырабатываемыми преимущественно кишечными микробами» • «Мнение о вредности микробов настолько распространено в публике, что малосведущий в этом вопросе читатель, вероятно, будет удивлен, что ему предлагают поглощать микробы в большом количестве. Между тем это мнение совершенно ошибочно: есть много полезных микробов, и среди них молочнокислые бактерии занимают особенно почетное место»

Пищеварительный тракт человека – наиболее населенный биотоп • Пищеварительная трубка длиной около 9 м (от полости рта до ануса) занимает второе после дыхательной системы место по площади поверхности – от 250 до 400 м 2, что сопоставимо с размерами теннисного корта. • В среднем в течение жизни через ЖКТ проходит около 60 тонн пищи.

Пищеварительный тракт человека – наиболее населенный биотоп • По весу «микробный орган» сопоставим с печенью (1 -1, 5 кг). • Пищеварительная система взрослого человека содержит около 1014 жизнеспособных микроорганизмов, что на порядок больше числа эукариотических клеток в организме хозяина. • Желудочно-кишечный тракт заселен представителями более 400 -600 различных видов.

Группы микроорганизмов кишечной флоры Микрофлора Индигенная (аутохтонная, резидентная, облигатная постоянная) Транзиторная (аллохтонная, факультативная, случайная)

Две популяции микроорганизмов в пищеварительном тракте

Две популяции микроорганизмов в пищеварительном тракте • Мукозная (пристеночная) микрофлора

Биопленки в разных отделах толстой кишки человека аппендикс поперечная ободочная кишка слепая кишка нисходящая ободочная кишка Bollinger et al. (2007)

Две популяции микроорганизмов в пищеварительном тракте • Просветная (полостная) микрофлора: 1. свободноживущие (free-living) 2. формирующие микроколонии 3. ассоциированные с корпускулярным материалом

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) (a) – слизистая толстой кишки больного с НЯК (b-d) – растительный материал из фекалий Macfarlane & Dillon (2007)

Группы микроорганизмов кишечной флоры Микрофлора Анаэробная (облигатно 1000: 1 анаэробная) Аэробная (факультативно анаэробная)

Группы микроорганизмов кишечной флоры Анаэробная микрофлора Палочки Грам+ Грам- Кокки Грам+ Неспорообр. Спорообр. Грам-

Грамположительные неспорообразующие облигатно-анаэробные палочки • Bifidobacterium (B. adolescentis, B. bifidum, B. infantis) • Eubacterium (E. eligens, E. hallii, E. limosum) • Collinsella (C. aerofaciens, C. intestinalis, C. stercoris)

Грамположительные спорообразующие облигатно-анаэробные палочки • Clostridium (C. difficile, C. nexile, C. perfringens)

Грамотрицательные неспорообразующие облигатно-анаэробные палочки • Bacteroides (B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. vulgatus) • Parabacteroides (P. distasonis, P. johnsonii, P. merdae) • Fusobacterium (F. mortiferum, F. necrophorum, F. nucleatum)

Грамположительные облигатно-анаэробные кокки • Ruminococcus (R. bromii, R. gnavus, R. luti) • Coprococcus (C. catus, C. comes, C. eutactus) • Peptoniphilus asaccharolyticus

Грамотрицательные облигатно-анаэробные кокки • • • Veillonella parvula Acidaminococcus fermentans Megasphaera elsdenii Subdoligranulum variabile Victivallis vadensis

Группы микроорганизмов кишечной флоры Аэробная микрофлора Палочки Грам+ Грам- Кокки Грам+ Неспорообр. Спорообр. Грам-

Грамположительные неспорообразующие факультативно-анаэробные палочки • Lactobacillus (L. acidophilus, L. fermentum, L. gasseri) • Propionibacterium (P. avidum, P. granulosum, P. propionicum) • Actinomyces israelii

Грамположительные спорообразующие факультативно-анаэробные палочки • Aneurinibacillus aneurinilyticus • Bacillus subtilis • Paenibacillus (P. lautus, P. thiaminolyticus)

Грамотрицательные неспорообразующие факультативно-анаэробные палочки • Escherichia coli • Cetobacterium somerae • Eikenella corrodens

Грамположительные факультативно-анаэробные кокки • Enterococcus (E. faecalis, E. faecium, E. durans) • Streptococcus (S. salivarius, S. mitis, S. infantarius) • Staphylococcus (S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus)

Трудности в изучении разнообразия микробиоценозов биотопов человека < 30% Традиционный подход (бактериологический метод) Новые методы (молекулярно-генетические) FISH DGGE/TGGE FISH/Flow cytometry T-RFLP SSCP Dot-blot hybridisation 16 S r. DNA sequencing

Функции нормальной микрофлоры Защитная Иммуномодулирующая Метаболическая

Продукты катаболизма органических соединений • Газообразные соединения (H 2 S, CH 4, H 2, CO 2, NH 3) • Органические кислоты (молочная, янтарная и др. ) • Жирные кислоты с короткой цепью (уксусная, пропионовая, масляная) • Спирты (этанол и др. ) • Фенольные и индольные соединения (фенол, индол, скатол, п-крезол) • Амины (гистамин, серотонин, путресцин, кадаверин, тирамин, агматин, пирролидин, пиперидин и др. )

Метаболическая функция микрофлоры • антигипертензивное действие (подавление активности ангиотензинпревращающего фермента) • гипохолестеринемическое действие (участие в метаболизме стеролов, желчных кислот и стероидных гормонов)

Мочекаменная болезнь и Oxalobacter formigenes • обнаружены почти у всех обследованных детей в возрасте 6 -8 лет и 60 -80% взрослых лиц • является важнейшим элементом гомеостаза – обеспечивая деградацию солей щавелевой кислоты (оксалатов), препятствует развитию гипероксалурии и возникновению мочекаменной болезни

Колонизационная резистентность Факторы естественной резистентности Факторы иммунитета Факторы нормальной микрофлоры

Факторы нормальной микрофлоры • Бактериоцины и бактериоциноподобные вещества (BLIS) • Микроцины • Бактериальные мурамидазы (лизоцимы) • Перекись водорода • Органические кислоты • Вещества различной химической природы (рейтерин и др. )

Рак толстой кишки • Каждый год в мире диагностируют примерно 940 тысяч случаев рака толстой кишки (РТК), из которых более 500 тысяч заканчиваются летальным исходом от осложнений этого заболевания [Stewart, Kleihues, 2003]. • В развивающихся странах эта форма сравнительно редка, но в государствах с высоким уровнем экономики РТК занимает второе место в cтруктуре злокачественных новообразований [Huycke, Gaskins, 2004].

Факторы риска развития рака кишечника [Moore & Moore, 1995] Низкий риск Lactobacillus S 06 Fusobacterium AB Eubacterium aerofaciens 1 Eubacterium BN Eubacterium aerofaciens 2 Peptostreptococcus DZ 2 Высокий риск Bacteroides vulgatus Eubacterium rectale 1 Ruminococcus torques Streptococcus hansenii Bifidobacterium longum Ruminococcus albus Peptostreptococcus productus 1 Bacteroides stercoris Bifidobacterium angulatum Eubacterium eligens 2 Ruminococcus gnavus Fusobacterium prausnitzii Eubacterium cylindroides Eubacterium rectale 2

Структура фекапентенов Фекапентен 12 Фекапентен 14

Метаболизм гликозидов с участием микрофлоры пищеварительного тракта Гликозидазы бактерий Циказин Метилазоксиметанол

Образование вторичных желчных кислот в реакции 7α-дегидроксилирования Холевая кислота 7α-дегидроксилаза бактерий Хенодезоксихолевая кислота Дезоксихолевая кислота Литохолевая кислота

Метаболизм азокрасителей [Chung et al. , 1992]

Анаэробные бактерии Грамположительные Грамотрицательные Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium infantis Clostridium clostridioforme Clostridium nexile Clostridium paraputrificum Clostridium ramosum Clostridium sporogenes Collinsella aerofaciens (Eubacterium aerofaciens) Eubacterium biforme Eubacterium hadrum Lactobacillus catenaformis Anaerococcus prevotii (Peptococcus prevotii) Coprococcus catus Ruminococcus bromii Ruminococcus productus (Peptostreptococcus productus) Bacteroides fragilis Bacteroides thetaiotaomicron Butyrivibrio sp. Faecalibacterium prausnitzii (Fusobacterium prausnitzii) Fusobacterium sp. Acidaminococcus fermentans Veillonella parvula Аэробные бактерии Грамположительные Bacillus sp. Lactobacillus sp. Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Грамотрицательные Citrobacter sp. Enterobacter aerogenes Escherichia coli Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Salmonella paratyphi Salmonella typhimurium Shigella dysenteriae

Аутизм (греч. αυτός, autos — «сам» , аутизм — погружение в себя) - феномен подчинённости познавательных процессов внутренним желаниям и тенденциям субъекта, в результате чего объективная реальность в представлении индивида выглядит более или менее искажённой. Чем сильнее информация об объективной реальности затрагивает самооценку, тем больше эта информация искажается. По данным статистики, аутизмом страдают 5 -10 детей на 10000.

«Человек дождя» (англ. Rain Man) — фильм 1988 года, драма, шедевр мирового кинематографа. 4 премии «Оскар» . Роль больного аутизмом (брат Рэймонд) сыграл Дастин Хоффман

Инфекционная природа аутизма – гипотеза E. R. Bolte (1998) • Bolte E. R. Autism and Clostridium tetani // Med. Hypotheses. 1998. V. 51, No. 2. P. 133 -144. • Значительная доля пациентов с аутизмом принимала антибиотики. • Столбнячный нейротоксин (СНТ), попав в головной мозг, нарушает высвобождение нейротрансмиттеров, протеолитически расщепляя синаптобревин – белок мембраны синаптических пузырьков. • Введение лабораторным животным СНТ в ткань головного мозга приводит к появлению симптомов аутизма. • Лечение детей с аутизмом антимикробными препаратами, эффективными в отношении патогенных клостридий, способствует улучшению состояния этих пациентов.

Новые виды микроорганизмов, возможно причастные к развитию аутизма • • Clostridium bolteae Song et al. 2003, sp. nov. Cetobacterium somerae Finegold et al. 2003, sp. nov. Anaerofustis stercorihominis Finegold et al. 2004, sp. nov. Anaerotruncus colihominis Lawson et al. 2004, sp. nov.

Болезнь Альцгеймера — дегенеративное заболевание центральной нервной системы, характеризующееся прогрессирующим снижением интеллекта, расстройством памяти и изменением поведения. Патогенез связан с отложением в ткани мозга амилоидного белка, вызывающим дегенерацию нейронов, и нарушением холинэргической синаптической передачи.

Болезнь Альцгеймера – социально значимое заболевание • По данным Cowley (2000) болезнь Альцгеймера (БА) встречается у 10% лиц старше 65 лет, 20% лиц в возрасте 75 -84 лет и 47% лиц старше 85 лет. • БА зарегистрирована почти у 4, 5 миллионов американцев. С 1980 г. число случаев заболевания возросло более чем в два раза. • Число американцев с БА Альцгеймера продолжает расти – к 2050 году количество пациентов увеличится до 11, 3 -16 миллионов.

Обнаружение трепонем полости рта в ткани головного мозга • Riviere G. R. , Riviere K. H. , Smith K. S. Molecular and immunological evidence of oral Treponema in the human brain and their association with Alzheimer's disease // Oral Microbiol. Immunol. 2002. V. 17, No. 2. P. 113 -118. • При исследовании коры головного мозга трепонемы были обнаружены у 14 из 16 лиц с болезнью Альцгеймера (БА), и только у 4 из 18 здоровых доноров (P<0, 001). • Антигены Treponema pectinovorum и/или Treponema socranskii обнаружены в коре головного мозга, тканях варолиева моста, гиппокампа и ганглиях тройничного нерва у лиц с БА.

Факторы, оказывающие влияние на состав микрофлоры пищеварительного тракта • • Физико-химические факторы Факторы хозяина (организма человека) Факторы микрофлоры Внешние факторы

Физико-химические факторы: • • температура р. Н анаэробиоз окислительно-восстановительный потенциал • наличие и доступность питательных веществ

Факторы хозяина (организма человека): • • • генетические факторы возраст заболевания стресс гормональные изменения состояние иммунитета, факторы естественной резистентности

Факторы микрофлоры: • адгезия • межмикробные взаимодействия • персистенция в биотопе

Внешние факторы: • • окружающая среда диета антибиотики и химиопрепараты лекарственные средства и немедикаментозное лечение • курение, алкоголь, зубные протезы и др.

Влияние пищевого рациона на микрофлору кишечника [Benno et al. , 1986]. • Сельские жители-японцы (Tsuyamamachi, префектура Miyagi) – 9 человек. • Отварной рис, лапша, японский хрен, фрукты, грибы, чистоуст величавый (папоротник), орляк обыкновенный, китайская капуста, огурцы, шпинат, соевый сыр (natto); рыба-сырец (sashimi), рыба, жаренная на открытом огне, и сушеная рыба; соленые презервы (shiokara), моллюски, ракообразные, морская водоросль; квашеные, маринованные овощи; яйца; мисо (ферментированная соевая паста из вареных соевых бобов и риса), соевый творог (tofu), нори (сушеная красная водоросль), японский зеленый чай.

Влияние пищевого рациона на микрофлору кишечника [Benno et al. , 1986]. • Городские жители-канадцы (Торонто, Онтарио) – 8 человек. • Говядина, жаренная на открытом огне; бекон, ветчина; яйца; цельное молоко; суп, содержащий молоко и кукурузу (пшеницу); мороженое, торты (пирожные), овощи и фрукты, хлеб, сливочное масло, кофе.

Влияние пищевого рациона на микрофлору кишечника [Benno et al. , 1986]. Японцы: Канадцы: • 23 рода, > 75 видов или • 18 родов, > 66 видов или биоваров • количество эубактерий, • количество бактероидов и бифидобактерий, бацилл, лецитиназоположительных лактобацилл и вейлонелл клостридий • частота встречаемости бифидобактерий Bacteroides uniformis, Clostridium innocuum и Bacillus spp.

1990 г. - в Копенгагене (Дания) состоялась первая международная конференция по антимикробной активности различных природных и синтетических соединений, не являющихся антибиотиками, так называемых «неантибиотиков»

Патогенетические лекарственные средства с выявленным антимикробным действием • • • Антидепрессанты (обратимые ингибиторы моноаминоксидазы, производные индола) Метралиндол (инказан) Пирлиндол (пиразидол) Тетриндол • Антидепрессанты (трициклические) Тримипрамин (сурмонтил) • Антидепрессанты (избирательные ингибиторы нейронального захвата) Фемоксетин (малексил) • • Нейролептики (производные фенотиазина) Хлорпромазин (аминазин) Промазин (пропазин) Алимемазин (терален, валлерган) Прохлорперазин (метеразин) Трифлуоперазин (трифтазин, стелазин) Флуфеназин (фторфеназин, модитен) Трифлупромазин (весприн) Тиоридазин (меллерил, сонапакс)

Патогенетические лекарственные средства с выявленным антимикробным действием • • Антигистаминные (производные фенотиазина) Прометазин (дипразин, пипольфен) Метдилазин • • Антигистаминные (аминоалкиловые эфиры) Дифенгидрамин (димедрол) Бромодифенгидрамин (амбодрил) Дименгидринат (дедалон) Клемастин (тавегил) • • Антигистаминные (замещенные этилендиамины) Хлоропирамин (супрастин) Трипеленнамин • • Антигистаминные (прочие) Ципрогептадин (перитол) Мебгидролин (диазолин) Хифенадин (фенкарол) Димебон

Патогенетические лекарственные средства с выявленным антимикробным действием • Адреномиметические (β-адреностимуляторы) Добутамин (добужект) • • Антиадренергические (β-адреноблокаторы) Анаприлин (пропранолол, индерал, обзидан, стобетин) Бупранолол • Коронарорасширяющие (фенилалкиламины) Оксифедрин (миофедрин, ильдамен) • Антагонисты ионов кальция (дигидропиридины) Амлодипин • Гипотензивные Метилдофа (альдомет, допегит) Диуретики (калийсберегающие) • • Амилорид Триамтерен

Патогенетические лекарственные средства с выявленным антимикробным действием • • • Нестероидные противовоспалительные Кислота ацетилсалициловая (аспирин) Ортофен (вольтарен, диклофенак-натрий) Напроксен Спазмолитические (антихолинергические) • Дицикломин Муколитические • Ацетилцистеин (бронхолизин) Противоязвенные • Квидитен • • Противоопухолевые (алкилирующие, производные бис-(β-хлорэтил)-амина) Проспидин Диброспидий хлорид (спиробромин) • Противоопухолевые (антиэстрогены) Тамоксифен (зитазониум) Местноанестезирующие • • Новокаин (прокаин) Лидокаин (лигнокаин, ксилокаин)

Дисбиоз (дисбактериоз) – любое количественное или качественное изменение нормальной микрофлоры, возникающее под действием экзогенных или эндогенных факторов на макроорганизм или микроорганизмы, и являющееся причиной заболевания, либо следствием уже существующих патологических процессов

Клиническая классификация дисбиоза Клиническая форма • Латентная (субклиническая) Степень компенсации • Компенсированная форма • Местная (локальная) • Субкомпенсированная форма • Распространенная, протекающая с генерализацией инфекции (сепсис, септикопиемия) • Декомпенсированная форма

Виды дисбиоза • Стафилококковый (S. aureus) • Клебсиеллезный (K. pneumoniae, K. oxytoca) • Протейный (P. mirabilis, P. vulgaris) • Кандидозный (C. albicans) и т. д.

Классификация микроэкологических нарушений (степени дисбиоза) • I – содержание бифидобактерий в норме (≥ 109 КОЕ/г фекалий) • II – содержание бифидобактерий ~ 108 КОЕ/г фекалий • III – снижение количества бифидобактерий (~ 107 КОЕ/г фекалий) • IV – значительный дефицит бифидофлоры (< 107 КОЕ/г фекалий)

Бактериологическая диагностика дисбиоза кишечника (метод серийных разведений) 0, 1 мл 10 -1 0, 1 мл 10 -3 0, 1 мл 10 -5 0, 1 мл 10 -7 10 -9 Кандида-агар, ЖСА, 5% кровяной агар, Среды для анаэробов среды для патогенных среда Эндо (в т. ч. бифидобактерий) энтеробактерий (в т. ч. среды обогащения)

Диагностика микроэкологических нарушений основана на: • характеристике качественного состава и определении количественного содержания микроорганизмов • выявлении продуктов метаболизма бактерий • определении биологических свойств представителей индигенной микрофлоры и возбудителей

Связь выраженности факторов персистенции E. coli со степенью дисбиоза кишечника

«Антиинтерфероновый» тест АИА+ (патент РФ № 2088938)

Сравнение методов выявления дисбиоза кишечника Антиинтерфероновый тест Бактериологический метод

Средства для коррекции дисбиозов Пробиотики Иммуномодуляторы Пребиотики Фитопрепараты

Пробиотик – пищевая добавка из живых микроорганизмов, которые оказывают благотворное влияние на организм хозяина, улучшая микробный баланс кишечника

Лактобациллы, составляющие основу пробиотиков: • • • L. acidophilus L. casei L. delbrueckii subsp. bulgaricus L. johnsonii L. reuteri L. brevis L. cellobiosus L. curvatus L. fermentum L. plantarum L. rhamnosus

Бифидобактерии, составляющие основу пробиотиков: • • B. bifidum B. adolescentis B. animalis B. infantis B. longum B. thermophilum B. breve

Бациллы, составляющие основу пробиотиков: • • B. subtilis B. cereus B. licheniformis B. pumilus B. clausii B. coagulans Paenibacillus polymyxa Brevibacillus laterosporus

Грамположительные кокки и дрожжи, составляющие основу пробиотиков: • Lactococcus lactis subsp. cremoris • Streptococcus salivarius subsp. thermophilus • Streptococcus thermophilus • Enterococcus faecium • S. diaacetylactis • S. intermedius • Saccharomyces boulardii

Пребиотик – пищевой ингредиент, который оказывают благотворное влияние на организм хозяина, избирательно стимулируя рост и/или активность микроорганизмов, уже присутствующих в кишечнике

Химическая структура фруктоолигосахаридов [Roberfroid et al. , 1998]

Отечественный иммуномодулятор полиоксидоний Полиоксидоний сополимер N-окиси 1, 4 этиленпиперазина и (Nкарбоксиэтил) -1, 4 этиленпиперазиний бромида, Мr от 60000 до 100000

Влияние полиоксидония на микроорганизмы • рекомендуемая терапевтическая концентрация ПО снижала АЛА и АКА клебсиелл, шигелл, пропионибактерий, клостридий, бактероидов и грибов рода Candida • под действием ПО отмечено повышение чувствительности изученных микроорганизмов к определенным антибиотикам групп линкозамидов, фторхинолонов, карбапенемов, цефалоспоринов

Лекарственные растения, наиболее эффективно подавляющие АЛА микроорганизмов Гемолитическая E. coli Ромашка Бессмертник Расторопша Солодка Кукурузные рыльца Фиалка Девясил Тысячелистник Липа Календула Klebsiella spp. Ромашка Бессмертник Расторопша Солодка Кукурузные рыльца Фиалка Девясил Цикорий Полынь Candida spp. Ромашка Полынь Шиповник S. aureus Ромашка Пижма Береза Clostridium spp. Одуванчик

Результаты использования мануальной терапии у пациентов с различными заболеваниями кишечника (n = 45) Нозологическая форма (n) Критерий положительной динамики состояния микробиоценоза кишечника Элиминация или снижение количества УПБ Снижение персистентного потенциала (АЛА, АИА) УПБ Повышение количества бифидобактерий, лактобацил л Улучшение клинической картины абс. % Хронический энтероколит (8) 6 75, 0 5 62, 5 6 75, 0 Хронический неспецифический колит (7) 5 71, 4 4 57, 1 3 42, 9 6 85, 7 Функциональные заболевания толстой кишки (30) 30 100 29 96, 6

Динамика показателей персистентных свойств штаммов УПБ в зависимости от показателей внутрикишечного давления у больных с патологией желчевыводящих путей до и после мониторной толстокишечной очистки (n = 28) Количество штаммов Показател и давления, мм. рт. ст. Уровень персистентного признака у выделенных штаммов УПБ АЛА (мкг/мл) АИА (ед. ) 0 -2 0 -1 2 -3 4 0 -10 - - 12 - - 10 - - 2 3 2 - 20 -30 3 - - 2 - - 30 -40 - 4 1 - 1 5 40 -60 и > После лечения 5 -6 10 -20 До лечения 3 -4 - 4 2 - 2 3 0 -10 - - - 10 -20 10 2 - 15 2 - 20 -30 11 5 - 9 2 - 30 -40 - - - 40 -60 и > - - -

Достижения микробной экологии человека • Успехи в изучении биологического разнообразия бактериальной и грибковой микрофлоры • Установление причинно-следственных связей между наличием определенного микроорганизма и развитием патологического процесса • Выявление гомеостатических функций нормальной микрофлоры • Расшифровка механизмов формирования микробных сообществ • Разработка новых методов диагностики микроэкологических нарушений • Обоснование использования существующих лекарственных средств и создание новых препаратов для коррекции дисбиотических нарушений

Благодарю за внимание!