Институт биоорганической химии им академиков М М Шемякина

Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ ТРАНСКРИПЦИИ-ТРАНСЛЯЦИИ: НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ДЛЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ И ИХ ДОМЕНОВ Люкманова Екатерина Назымовна Лаборатория биоинженерии белка, ИБХ РАН

Биосинтез белка транскрипция трансляция

История открытия бесклеточных белоксинтезирующих систем (ББС) 1950, Winnick – демонстрация возможности белкового синтеза с использованием экстракта, полученного после разрушения клеток 1958, Roberts – используя отдельные компоненты разрушенной клетки, показана ключевая роль рибосом, как белок-синтезирующих машин 1960, Lamborg&Zamecnik – создание первых ББС, представляющих собой смесь неочищенного клеточного экстракта, аминокислот, АТФ и ГТФ. 1963, Nirenberg – удаление эндогенных м. РНК из экстракта и внесение экзогенной м. РНК привело к ее трансляции и синтезу целевого белка 1988, Спирин А. С. – создание белоксинтезирующей системы длительного действия • изучение биосинтеза белка и механизмов его регуляции • скрининг белков с неизвестными функциями • белковая инженерия in vitro • аналитическая и препаративная продукция рекомбинантных белков

Бесклеточные белоксинтезирующие системы клеточный экстракт + аминокислоты + экзогенная матрица + + энергетические компоненты + система регенерации энергии + кофакторы = бесклеточная белоксинтезирующая система Экстракты: Приготовление экстракта Прокариотические (основанные на экстракте Escherichia coli) Эукариотические (на основе экстракта пшеницы, ретикулоцитов кролика, клеток насекомых или человеческих клеток) Компоненты экстрактов: рибосомы, все ферменты и факторы, необходимые для транскрипции и трансляции Imataka et. al. , 2011

Бесклеточные белоксинтезирующие системы. Матрицы. Ионный состав. • ДНК-независимая ББС Ø м. РНК Ионы, важные для работы ББС: Mg 2+, K+, NH 4+ • ДНК-зависимая ББС транскрипции- трансляции Ø плазмидная ДНК, содержащая ген целевого белка и Т 7 промотор Ø ПЦР-фрагмент, содержащий ген целевого белка и Т 7 промотор + Т 7 -РНК-полимераза В каждом конкретном случае требуется оптимизация по ионному составу и концентрации матрицы! Bernhard et al

Бесклеточные системы транскрипции-трансляции. Пути расходования энергии. • • • NTP → NDP при транскрипции GTP → GDP при трансляции ATP → AMP присоединении АК к t. RNA

Бесклеточные системы транскрипции-трансляции. Регенерация NTP. ADP + X-P фермент NDP + ATP НДК X – фосфоенолпируват COOH, ATP + X NTP + ADP фермент - пируваткиназа C-О-P CH 2 X – ацетилфосфат CH 3, фермент - ацетилкиназа C-О-P X – креатинфосфат COOH, CH 2 NH C-NH 2 N-P фермент - креатинкиназа

Бесклеточные системы транскрипции-трансляции. Устройство реактора (batch). выход белка ≤ 0. 5 мг/мл, эффективность работы ≤ 2 часа

Бесклеточные системы длительного действия : диализного типа – CECF (continuous exchange cell-free) (А) и проточного типа – CFCF (continuous flow cell-free)(Б) (А) Spirin et. al, Science, 1988 (Б) Endo et al, J Biotech 1992 Компоненты питающей смеси: ATP, GTP, UTP, CTP, аминокислоты, энергетические компоненты выход белка до 6 мг/мл, эффективность работы до 24 часов

Преимущества бесклеточных систем синтеза • • • «Эксклюзивный» синтез целевого белка с чистотой до 80% Возможность манипулирования составом реакционной смеси «Открытость» системы для добавления лигандов, кофакторов, специальных агентов Низкая цена по сравнению с бактериальной продукцией Эффективность по времени (1 день → несколько миллиграмм целевого белка) Масштабируемость до 100 литров Maslennikov et. al. , PNAS, 2010

Бесклеточные белоксинтезирующие системы токсичные белки, содержащие S-S связи мультимерные белки мембранные белки, содержащие пост-трансляционные модификации белки, содержащие селективные метки белки, содержащие неприродные АК

Бесклеточный синтез N-гликозилированных белков Эукариотические экстракты Добавление в ТС микросом из клеток поджелудочной железы собаки (Lingappa et al, PNAS 1978) Прокариотические экстракты Добавление в ТС компонентов из pgl локуса Граммотрицательной бактерии Campylobacter jejuni продуцированных в E. coli и солюбилизированных в 0. 1% DDM • Фермента олигосахарилтрансферазы (OST, Pgl. B) • Липид-связанных олигосахаридов (LLO) Встраивание эукариотических N-гликанов возможно требует использования модифицированных LLO и дальнейшего ферментативного трансгликозилирования (Schwarz et al, Nat Chem Biol, 2010) (Guarino et al, Glycobiology 2011)

Бесклеточный синтез белков, содержащих S-S связи Эукариотические Прокариотические экстракты Добавление в ТС глутатиона GSSG в присутствии микросом • Обработка экстракта йодацетамидом (IAM) • Добавление в ТС глутатионов GSSG/GSH • Добавление в ТС фермента дисульфид-изомеразы E. coli (Dsb. C) (Scheele et al, JBC 1982) (Swartz et al, J. Biotechnology, 2011) (Goerke et al, Biotechnology&Bioengineering 2008)

Бесклеточный синтез белков, содержащих неприродные АК Использование мутантных tyrosyl-t. RNA синтетазы (Tyr. RS), и t. RNATyr из археи Methanococcus jannaschii в БСС на основе экстракта E. coli позволяет встраивать неприродные аналоги тирозина и фенилаланина по стоп кодону TAG ("amber"). p-acetyl-Lphenylalanine p-azido-L-phenylalanine O-methyl-L-tyrosine (Goerke et al, Biotechnology&Bioengineering 2009)

Бесклеточный синтез мембранных белков (МБ) • Фармакология • Медицина • Промышленные ферменты • Экология • Нанотехнологии Синтез МБ: a. в виде осадка ТС b. в присутствии мицелл детергента c. в присутствии липидов С 1. в присутствии бицелл С 2. в присутствии липид-белковых нанодисков С 3. в присутствии липосом Bernhard et. al. , 2010

Использование ББС для структурных исследований МБ (Junge et al, Cell Mol Life Sci, 2008) МБ человека, NMR (Klammt, Maslennikov et al, Nature methods, 2012) multidrug транспортер Emr. E, X-ray (Chen et al, PNAS, 2007) Бактериальные рецепторные His киназы, NMR (Maslennikov et al, PNAS, 2010) Протеородопсин, NMR (Reckel et al, Angew Chem, 2011)

Пространственные структуры МБ, полученные в ИБХ РАН гомодимер ТМ домена рецептора фактора роста сосудистого эндотелия VEGFR 2 гомотример мутантного варианта VEGFR 2(V 769 E) (Mineev, Arseniev et al, 2013) гомодимер ТМ домена рецепторной тирозин киназы Erb. B 3 человека (TM-Erb. B 3) (Mineev et al, BBA, 2011)

Бесклеточная продукция МБ в присутствии липид-белковых нанодисков Emr. E (multidrug transporter) Katzen et. al. , Trends in Biotech. , 2009

Сравнение различных подходов для продукции мембранных белков в структурированном виде МБ с различной топологией • TM-Erb. B 3 (гомодимерный трансмембранный домен тирозинкиназы человека Erb. B 3, 1 TM) • VSD (вольт-сенсорный домен K+ канала Kv. AP из Aeropyrum pernix, 4 TM) • ESR (бактериородопсин из Exiguobacterium sibiricum, 7 TM) Тестируемые подходы синтез в присутствии • детергентных мицелл • липид-детергентных бицелл • липид-белковых нанодисков (ЛБН) • ренатурация из осадка трансляционной смеси (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

Бесклеточная продукция МБ в присутствии мицелл детергентов (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

Бесклеточная продукция МБ в присутствии мицелл детергентов Ни один из тестируемых детергентов не обеспечил синтеза функционально активного ESR и структурированных TM-Erb. B 3 и VSD (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

Бесклеточная продукция МБ в присутствии DMPC/DHPC бицелл (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

Бесклеточная продукция МБ в присутствии липид-белковых нанодисков Тестируемый липидный состав ЛБН 1) DMPC 3) POPC Пустые ЛБН 2) DMPG 4) POPC/DOPG (3: 2) TM-Erb. B 3 VSD ESR Только ЛБН, состоящие из насыщенных липидов, стабильны при ко-трансляционном встраивании МБ (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

Бесклеточная продукция МБ в присутствии липид-белковых нанодисков Ни в одном случае с ЛБН не удалось синтезировать VSD в структурированном виде Для продукции VSD были разработаны системы рефолдинга (ренатурации) из осадка ТС (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

N-концевые белки-партнеры для увеличения эффективности бесклеточной продукции рецепторов семейства GPCR • ~ 800 генов в геноме человека (отвечают за рецепцию света, гормонов, запахов, нейромедиаторов) • GPCR – мишени для ~ 30% современных лекарственных препаратов эффективность синтеза GPCR возросла в 5 -38 раз Патентная заявка РФ, Люкманова и д. р. , Acta Naturae 2012

Ренатурация мускаринового ацетилхолинового рецептора М 1 типа из осадка трансляционной смеси осадок трансляционной смеси бицеллы CHAPS/DMPC солюбилизация 1% SDS смешанные мицеллы DDM/CHS перевод в подходящую мембраномоделирующую среду для ренатурации мицеллы DPC ВЭЖХ анализ эффективности взаимодействия с телензипином липосомы POPC

Бесклеточная продукция ТМ фрагментов β 2 -адренорецептора человека (GPCR) S 1/DPC S 2/DPC S 12/HFIP Преимущества БСС: • Быстрая наработка (прямая экспрессия) миллиграммовых количеств гидрофобных пептидов (ТМ фрагментов МБ) • Эксклюзивный синтез целевого белка S 1 MERDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQTGSHHHHHH MFERLQTVTNYFITSLAVADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTGSHHHHHH S 2 MERDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQTVTNYFITSLAVADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTGSHHHHHH S 12

Бесклеточная продукция потенциалочувствительных доменов Na+ каналов эукариот • На ПЧД 2 й псевдосубъединицы локализован участок связывания бета-токсинов из яда скорпионов • Каналы семейства Nav – перспективная мишень для создания новых лекарственных препаратов, нацеленных на лечение судорожных расстройств, хронической боли, периодического паралича, миотонии, атаксии и аритмий • Каналы семейства Nav – мишени для создания новых инсектицидов

ЯМР-исследование ПЧД-Nav 1. 4 • Исследование 13 C 15 N-меченого ПЧД-Nav 1. 4 (5% LPPG, p. H 6. 0) • Получен набор 2 D и 3 D спектров для отнесения сигналов • В спектрах наблюдаются ~ 130 спиновых систем (близко к ожидаемому) • В настоящее время получено последовательное отнесение для 63 остатков (~ 40%) • Наблюдаются нарушения спиральной структуры «вольт-сенсорной спирали» S 4 Δδ 13 Сα Δδ 13 С’ S 1 S 2 S 3 S 45

Благодарю за внимание!