Инициация трансляции Мет-т РНКi ГТФ П Мет 5 -кэп

Инициация трансляции Мет-т. РНКi ГТФ П Мет 5’-кэп АУГ А

Элонгация трансляции Пептидилтрансфераза П Мет 5’-кэп АУГ А АК аа-т. РНК ГТФ

Элонгация трансляции П А Мет АК 5’-кэп АУГ Транслоказа (EF-2), ГТФ

Элонгация трансляции П Мет АК 5’-кэп АУГ А АК

Терминация трансляции П А e. RF УАГ

Терминация трансляции e. RF УАГ

Постсинтетическая модификация белков n Частичный протеолиз (удаление N-концевого МЕТ и сигнального пептида, образование активных форм ферментов и гормонов)

Постсинтетическая модификация белков (продолжение) n n n n n Объединение протомеров и формирование четвертичной структуры белков Образование внутри- и межцепочечных S—S –связей Ковалентное присоединение кофакторов (пиридоксальфосфат, биотин) Гликозилирование (гормоны, рецепторы) Модификация остатков аминокислот: гидроксилирование ПРО и ЛИЗ (коллаген) йодирование ТИР (тиреоглобулин) карбоксилирование ГЛУ (факторы свертывания крови) Фосфорилирование Ацетилирование (гистоны) Пренилирование (G-белки) Др.

Природные и синтетические ингибиторы биосинтеза белка Продукт Механизм действия Антибиотики Доксорубицин Актиномицин D Рифампицин Стрептомицин Внедряются между парами оснований ДНК и нарушают раскручивание цепей (репликацию и транскрипцию) Ингибирует РНК-полимеразу прокариот Тетрациклины Ингибирует инициацию трансляции (связываясь с 30 S-субъединицей) Блокируют поступление аа-т. РНК в А-центр (--//--) Левомицетин Ингибирует пептидилтрансферазу Эритромицин Подавляет транслокацию Токсины

Природные и синтетические ингибиторы биосинтеза белка (продолжение) Продукт Механизм действия Токсины α-Аманитин Ингибирует РНК-полимеразу II эукариот Рицин Катализирует распад р. РНК большой субъединицы рибосом эукариот Подавляет транслокацию рибосом (модифицирует EF-2) Дифтерийный токсин

Регуляция биосинтеза белка в клетке

lac-оперон

lac-оперон Глюкоза + Лактоза -

lac-оперон Глюкоза + Лактоза +

lac-оперон Глюкоза – Лактоза +

Регуляторная часть генов эукариот устроена более сложно Имеются энхансеры (элементы, усиливающие транскрипцию), сайленсеры (ослабляющие), HRE (hormone response element) Белковые факторы транскрипции могут связываться с любым из этих элементов и, тем самым, регулировать функции генов В качестве индукторов биосинтеза белка на генетическом уровне могут выступать ü гормоны (стероидные, тиреоидные), ü жирорастворимые витамины (D, A), ü металлы и др.

Пример инициирующего комплекса транскрипции гена эукариот

Современные методы молекулярной биологии

Ферменты – главный «инструмент» в работе молекулярного биолога n n n ДНК-полимеразы ДНК-лигазы Рестриктазы – «разрезают» молекулу ДНК в строго определенных местах (в области палиндромов) А РОЗА УПАЛА НА ЛАПУ АЗОРА 5’ -----GAATTC------3’ УМЕР И МИР ЕМУ 3’------CTTAAG------5’ MADAM, I’M ADAM Рестриктаза Eco. RI

Исследование последовательности нуклеотидов ДНК (метод Сэнджера) Основан на ДНК-полимеразной реакции. Реакцию проводят в 4 -х пробирках, в каждую из которых вносится: § матрица (исследуемый фрагмент ДНК) § праймер § субстраты (д. АТФ*р/а, д. ГТФ, д. ЦТФ, д. ТТФ) § ДНК-полимераза § один из четырех видов дидезоксинуклеотидов (дд. АТФ, дд. ГТФ, дд. ЦТФ, дд. ТТФ)

После включения дидезоксинуклеотида в растущую цепь ДНК ее синтез останавливается НО – СН 2 3’ ОН О НО – СН 2 2’ ОН рибоза 3’ ОН О НО – СН 2 2’ Н дезоксирибоза 3’ Н О 2’ Н дидезоксирибоза

матрица 3’ ААТТГ -----Ц----------Ц-----5’ ТТААЦ -----Г дд. ГТФ, д. ГТФ и др. матрица 3’ ААТТГ -----Ц----------Ц-----5’ ТТААЦ -----Г-----------Г

Блот-анализ ДНК (Саузерн-блот) Этапы: 1. Выделение ДНК из биологического материала 2. Разрезание ДНК рестриктазами 3. Разделение фрагментов (электрофорез в агарозном геле) 4. Перенос на нитроцеллюлозу и денатурация ДНК 5. Блокирование пустых зон избытком ДНК 6. Обработка зондом и образование гибридов зонд – мишень (зондом является одноцепочечная молекула ДНК, комплементарная искомой и меченая р/а фосфором Р 32) 7. Отмывка несвязанного зонда и ауторадиография

Саузерн-блот

Геномная дактилоскопия (метод «отпечатков пальцев ДНК» ) Применение: § Идентификация личности § В судебной медицине – установление принадлежности пятен крови, спермы, др. биологического материала Жертва Обвиняемый

Геномная дактилоскопия (применение) § Установление отцовства (материнства)

Геномная дактилоскопия (применение) § Комплексная диагностика ряда наследственных заболеваний § Поиск участков в ДНК, ответственных за развитие определенной патологии

Биочипы (DNA microarray technology) ДНК-чип позволяет проводить анализ большого числа генов одновременно Этапы: n Изготовление чипа (иммобилизация небольших одноцепочечных фрагментов ДНК на ячейках пластины) n Проведение реакции гибридизации флюоресцентномеченых исследуемых образцов с чипом n Компьютерный анализ результатов

Биочипы (DNA microarray technology)

ПЦР (полимеразная цепная реакция) Kary Mullis (р. 1944) Нобелевская премия по химии 1993

ПЦР – это способ получения достаточного для анализа числа копий ДНК (гена или его фрагмента) В пробирке смешиваются: исследуемый материал (образец ДНК), д. НТФ (субстраты для синтеза), ДНК-полимераза (Taqполимераза), праймеры ТЕРМОЦИКЛЕР 1. Нагревание до 900 С (денатурация ДНК) 2. Охлаждение до 550 С ( «отжиг» праймеров) 3. Нагревание до 750 С (удвоение цепей) повторение цикла

ПЦР Применение: • Диагностика бактериальных и вирусных инфекций • Генетическое типирование (определение носительства мутантных генов)

Хорея Гентингтона (ПЦР-диагностика) N ХГ

Хорея Гентингтона (ПЦР-диагностика)

Клонирование

Клонирование клеток

Клонирование отдельных генов (основные понятия) Вектор – носитель, в который встраивается чужеродная ДНК с целью клонирования Виды векторов: n плазмида n бактериофаг n хромосомы дрожжей

Клонирование отдельных генов (принцип)

Клонирование отдельных генов (применение) Ø Клонирование бактеральных и вирусных генов – создание вакцин Ø Клонирование генов человека – 1. Получение лекарственных препаратов белковой природы. Уже получены: эритропоэтин, инсулин, соматотропин, интерфероны, VIII фактор свертывания крови, тканевый активатор плазминогена, факторы роста 2. Генная терапия

Спасибо за внимание! Успехов!