Ингибиторы матричных биосинтезов I. Ингибиторы репликации – противоопухолевые препараты 1. Антрациклиновые антибиотики (дауномицин, доксорубицин) – интеркалируют между парами оснований ДНК, нарушают репликацию и транскрипцию Дауномицин 2. Алкилирующие агенты – алкилируют основания ДНК и нарушают репликацию и транскрипцию Мелфалан Циклофосфан Темозоломид
3. Ингибиторы топоизомераз вызывают появление разрывов в ДНК и нарушают репликацию и транскрипцию Топоизомеразы катализируют топологические перестройки в ДНК. Топо I вносит одно- , а топо II – двухцепочечные разрывы с последующей их сшивкой и восстановлением целостности молекулы ДНК, что обуславливает мобильность структуры ДНК, необходимую для конформационных изменений ДНК в процессах матричного синтеза Ингибитор топо I камптотецин Ингибитор топо II этопозид 4. Блеомицин - смесь гликопептидных антибиотиков, выделенных из штамма Streptomyces verticillus. Подавляет синтез ДНК и белка. Взаимодействие с ДНК сопровождается ее фрагментацией и появлением хромосомных аберраций.
II. Ингибиторы репликации – антибактериальные препараты Номермицин, новобиоцин - ингибируют топо II , нарушают репликацию и т транскрипцию III. Ингибиторы транскрипции – антибактериальные препараты Рифамицины - связываются с бактериальной РНК-полимеразой и препятствуют началу транскрипции
IV. Ингибиторы трансляции – антибактериальные препараты Тетрациклины - ингибируют элонгацию: связываются с 30 S субъединицей рибосомы и блокируют присоединение аа-т. РНК в А-центр Левомицетин - присоединяется к 50 S субъединице рибосомы и ингибирует пептидилтрансферазную активность Эритромицин - присоединяется к 50 S субъединице рибосомы и ингибирует транслокацию Стрептомицин - ингибирует инициацию трансляции. Связывается с 30 S субъединицей рибосомы, вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в м. РНК Рибосома Эукариоты 80 S (40 и 60 S) Прокариоты 70 S (40 и 60 S)
Токсины – ингибиторы матричных биосинтезов Альфа-аманитин обладает очень высоким сродством к РНК-полимеразе II. РНК-полимераза I нечувствительна к нему, а РНК-полимераза III мало чувствительна. В клетк, аманитин связывает фермент, блокирует его активность, что приводит к прекращению синтеза белков и к разрушению клетки. У человека при отравлении больше всего страдают клетки печени и почек. LD 50 0, 1 мг/кг. Рицин – белок клещевины, обладает N-гликозилазной активностью, удаляет 1 остаток аденина из 28 S РНК большой субъединицы рибосомы и ингибирует синтез белка. LD 50 0, 3 мг/кг. Дифтерийный токсин - полипептид с молек. массой около 72 000; состоит из субъединицы А (проявляет активность АДФ-рибозилтрансферазы) и В (взаимодействует с клеточными рецепторамии и обеспечивает проникновение в клетку). Дифтерийный токсин АДФ-рибозилирует фактор элонгации EF 2, что приводит к ингибированию синтеза белка и гибели клетки.
Интерфероны ингибируют синтез белков, необходимых для репликации вирусов • индуцируют синтез 2', 5'-олигоаденилатсинтетазы. Она стимулирует синтез 2', 5'-олигоаденилатов, которые в свою очередь активируют рибонуклеазу L , разрушающую одноцепочечные РНК. • индукцируют синтез протеинкиназы , которая фосфорилирует и тем самым блокирует фактор инициации трансляции e. IF 2 , что приводит к подавлению синтеза белка в зараженной клетке.
Ферменты, необходимые для получения гена или его фрагмента 1. Обратные транскриптазы - ферменты, которые катализируют синтез ДНК на матрице РНК. 2. Рестриктазы – бактериальные эндонуклеазы. Узнают специфическую последовательность нуклеотидов в ДНК из 4 -6 или 8 -12 пар оснований и расщепляют обе нити. 3. ДНК-лигаза – катализирует образование фосфодиэфирной связи между 3’-OH группой одного фрагмента и 5’-фосфатом другого.
Получение рекомбинантной ДНК с помощью рестриктаз и ДНК-лигазы ---3’ ---5’
Клонирование ДНК в бактериальных клетках Наращивание культуры клеток
Использование трансформированных бактериальных клеток для получения рекомбинантной ДНК и рекомбинантных белков Наращивание культуры клеток
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ПЦР – метод амплификации копий фрагмента ДНК in vitro Реакционая смесь для ПЦР ДНК –матрица Субстраты (д. АТФ, д. ГТФ, д. ЦТФ, ТТФ) Термостабильная Taq-полимераза термофильной бактерии Thermus aquaticus, сохраняет активность при 95 °С Ионы Mg 2+ Два праймера – синтетические фрагменты однонитевой ДНК (20 - 30 нуклеотидов), выполняющие функцию затравки. Они комплементарны 3’-концевым последовательностям каждой из нитей ДНК амплифицируемого участка. Их концентрация >> концентрации ДНК-матрицы
Полимеразная цепная реакция Амплифицируемый участок ДНК Цепь 1 3’ Цепь 2 5’ Цикл 1 Нагревание, вызывающее расплетание нитей Отжиг, во время которого присоединяются праймеры Цепь 1 3’ Цепь 2 5’ Цепь 1 3’ Элонгация цепей термостабильной ДНК-полимеразой 5’ 5’ Цепь 2 5’ Цикл 2
Цикл 2 Денатурация ДНК и отжиг Цепь 1 3’ Цепь 2 5’ Циклы с 3 -го по 20 -й обеспечивают образование 106 копий
Структура инсулина человека А-цепь В-цепь Участок связывания с рецептором
Получение инсулина человека в клетках E. coli Ген В-цепи инсулина Ген А-цепи инсулина Вектор Трансформация клеток E. сoli плазмидами и селекция трансформированных клеток Бактериальная Хр Вектор Наращивание культуры E. coli А-цепь Выделение и очистка А- и В-цепей инсулина В-цепь Пространственная укладка цепей инсулина и окисление остатков цистеина А-цепь NH 2 B-цепь NH 2 СООН Активный инсулин СООН Дисульфидные связи
Лауреаты Нобелевской премии по химии 2012 года Роберт Лефковиц (Robert Joseph Lefkowitz) и Брайан Кобилка (Brian Kobilka). Фото с сайтов dukecheck. com и www. zimbio. com
Схема теории тройничного комплекса. Изображение с сайта www. nobelprize. org
Изображение β-адренорецептора в момент связывания с лигандом и G-белком. С сайта www. nobelprize. org
Sir John B. Gurdon Shinya Yamanaka Нобелевская премия 2012 г по медицине и физиологии за открытие возможности перепрограммироваия зрелых клеток в полипотентные
Скачать презентацию Ингибиторы матричных биосинтезов I Ингибиторы репликации противоопухолевые
Ингибиторы матричных биосинтезов. ПЦР..ppt