Индуцированные плюрипотентные стволовые (ИПС) клетки for the discovery

Индуцированные плюрипотентные стволовые (ИПС) клетки

for the discovery that mature cells can be reprogrammed to become pluripotent Нобелевская премия по физиологии и медицине 2012 года

Фибробласты

фибробласты Дифференцированные клетки Не дают других клеточных типов При делении фибробласта получается два новых фибробласта Подвержены контактному торможению

Стволовые клетки при делениях могут давать любые дифференцированные клетки, могут самоподдерживаться

до нашей эры до ИПС клеток Эмбриональные стволовые клетки – хороший источник плюрипотентных клеток, но этические, технические и проч. проблемы Клонированные ЭС (ntES) – еще лучше, но тоже много проблем

Если цель получить стволовые клетки из соматических, какие факторы нужно добавить?

Virus vs. retrovirus

Вектора на основе ретровирусов Обеспечивают встройку ДНК в случайное место в геноме Очень удобны, новый рекомбинантный ретровирус, содержащий необходимый ген, можно создать за неделю! Количество встроек непредсказуемо

Retroviral vectors: • Ретровирусные вектора созданы на основе Moloney murine leukemia virus (Mo-MLV). Этот вирус заражает и мышинные и человеческие клетки. • для создания вектора вирусные гены, gag, pol and env, заменяют генноинженерной консрукцией, которую экспрессируют в специальной клеточной линии - упаковщике. • В вирионы упаковывается только интересующая конструкция, т.к. она содержит сигнал упаковки. • Для того чтобы предотвратить появление суперзомбивируса из вектора удаляют все возможные участки гомологии с природными ретровирусами.

К сожалению ретровирусы заражают только делящиеся клетки Инсерционный мутагенез Retroviral vectors- Limitations

Lentiviral Vectors: относятся к тому же семейству, но могут заражать и делящиеся и покоящиеся клетки современные лентивирусные вектора созданы на основе ВИЧ

MEF iPS Oct-4 Sox2 Стратегия отбора генов - кандидатов

24 гена кандидата, все ли они важны?

Перебор вариантов по 23 фактора

Необходимы все 4 фактора? Без Oct4 или Klf: колоний нет Без Sox2: колонии формируются, но фенотип отличается Без c-Myc: очень низкая эффективность

Функции репрограммирующих факторов Sox2- самообновление Oct4- главный ген плюрипотентности, дедифференцировка Klf4- p53 pathway, онкоген c-Myc- ацетилирование гистонов, онкоген

тератомы

Первое поколение ИПС клеток не давало взрослых химер

Спустя 11 месяцев второе поколение ИПС клеток

второе поколение ИПС клеток Основное отличие – Nanog- или Oct4-активируемый ген устойчивости для селекции репрограммированных клеток Те же 4 гена Гораздо больше похожи на ЭС клетки, чем первое поколение

ИПС клетки способны давать химер

Мышата полученные из ИПС клеток

Опухоли у «ИПС-мышей» из-за актвации онкогена c-myc наблюдались у 10% мышей

Спустя еще 4 месяца – первые ИПС клетки человека

Та же технология, что и для ИПС клеток мыши Удалось получить ИПС клетки из фибробластов взрослого донора (36 лет) В целом, процесс получения ИПС клеток человека дольше колонии формируются только на 25 день ИПС клетки человека

Дифференцируются in vitro в производные трех зародышевых листков

Формируют тератомы

One month later Used Oct3/4, Sox2, Nanog and Lin28

Around the same time (Dec 2007)