Импульсная Фурье ЯМР спектроскопия Два типа приборов в ЯМР: 1) Постоянное возбуждение с меняющейся частотой 2) Импульсное возбуждение с последующим Фурье преобразованием 1
Как выбирается длина импульса в ЯМР спектроскопии? 1. Короткому импульсу монохроматического излучения с частотой ν 0 и длиной τ в частотной области соответствует определенная полоса частот Δν , центрированная на частоте ν 0 2. С уменьшением длины импульса ширина полосы частот увеличивается и наоборот. 3. Для типичного импульса длительностью 10 мксек центральная «плоская» часть полосы, где амплитуда разнится в пике не более чем на 1%, имеет ширину 16 к. Гц 4. Стандартная ширина протонных химических сдвигов у белков 15 ppm. ν 0 5. В магнитном поле с напряженностью 7. 05 Т (ν 0 =300 МHz для 1 H) интервал 15 ppm соответствует полосе частот 4. 5 KHz для 1 H. В магнитном поле 14. 1 Т эта полоса составит 9 KHz. 2
Математическое Фурье преобразование Временной спектр ЯМР этанола Частотный спектр ЯМР этанола → ← Время Частота 3
Экспериментальные схемы с применением одиночного импульса 1) Система спинов в равновесии Импульс 2) Короткий прямоугольный импульс. Отклик системы на импульс Время релаксации 3) Отклик системы спинов на импульс и его регистрация 4) Временная задержка, необходимая, чтобы система пришла в равновесие (обычно 2 -3 Т 1) 5) Многократное накопление Мертвое время Последовательность событий: Длина импульса определяет угол поворота вектора магнетизации Угол поворота вектора магнетизации α, (в радианах) равен α = γ B 1 tp Длина типичного 90 о импульса около 10 -5 c. Для 180 о импульса эта величина в 2 раза 4 больше.
S I Эффект Оверхаузера Схематическое представление эффекта Оверхаузера Молекула содержит два спина I и S, которые не перекрываются, так что каждый из них может быть представлен как синглет (а). После насыщения спина S величина сигнала спина I может увеличиться (b), уменьшиться (c), стать отрицательной (d) NOE = (I –I 0)/I 0 NOE ~ f(r. IS) × f(τc) f(r. IS) = 1/(2 + A r 6 IS) Уравнения, описывающие эффект Оверхаузера, показывают, что 1) Эффект проявляется в изменении интенсивности линий в спектре ЯМР 2) Величина эффекта зависит от двух вкладов, один из которых связан с расстоянием между спинами, а второй от вращательного корреляционного времени молекулы τc. 3) Эффект проявляется только для близких соседних спинов, расстояние между которыми меньше 5 -6 Å. 5
Двумерная ЯМР спектроскопия Двумерная корреляционная ЯМР спектроскопия – метод, который коррелирует (сравнивает между собой) два сигнала, объединенные некоторым общим взаимодействием. Четыре временных периода 1) приготовление 2) развитие или эволюция(время t 1) 3) смешение 4) детектирование (время t 2) Двумерный ЯМР на практике означает, что измеряемый на выходе сигнал является функцией двух времен, а после Фурье-преобразования – двух частот Общая схема двумерного ЯМР очень гибкая и на сегодня известны сотни разных последовательностей, предназначенных для решения тех или иных конкретных задач. Например, HMQS-HOHAHA есть система импульсов состоящая из Heteronuclear multiple-quantum correlation experiment +Homonuclear Hartman-Hahn spectroscopy Важными и относительно простыми схемами в ЯМР являются: 1) Корреляционная спектроскопия (COSY), которая идентифицирует пары протонов, связанные скалярным спин-спиновым расщеплением 2) Корреляционная спектроскопия (NOESY), которая идентифицирует близость 6 пар протонов, связанные эффектом Оверхаузера
Корреляционная ЯМР спектроскопия (COSY) Одномерный спектр ЯМР для двух 1 H-1 H спинов Контурная карта (смотри следующий слайд) 1 H-1 H COSY спектра двух связанных спинов. Картина всегда симметрична относительно диагонали. Черные кружки представляют диагональные пики; открытые кружки кросс-пики. Появление последних означает, что два спина сближены. Заметим, однако, что расстояния между 7 ними в COSY не определяется.
1 D и 2 D ЯМР спектры небольшого белка, протеазного ингибитора K (57 аминокислот) в 0. 01 M, p. D 3. 4, 25 o. C, 360 MHz. Контурное представление COSY спектра. Третья координата - интенсивность. 1 D 1 H спектр Этажерочное представление COSY спектра Контурное представление COSY спектра наглядно показывает способность к взаимодействию различных групп протонных пиков. Укажем лишь на один пример. Так, имеется взаимодействие высокопольных метилов (ω1 = -0. 9 ppm, ω2 = -0. 9 ppm). Картинка всегда 8 симметрична относительно диагонали.
Nuclear Overhauser Enhanced Spectroscopy (NOESY). Вверху: последовательность импульсов в NOESY. Внизу: схематическая контурная карта спектра, состоящего из пяти резонансных линий (А, B, C, D и E). Появление трех кросс-пиков свидетельствует, что резонансы, соответствующие этим пикам сближены в пространстве (А и C, B и D, B и Е). Контурная карта протонного двумермого NOE спектра бычьего трипсинового панкреатического ингибитора (360 MHz, концентрация белка 0. 02 М, p. H 3. 8). На карте выявляется множество кросс-резонансных пиков, отражающих сближенность в пространстве некоторых аминокислот. Аминокислоты обозначены (A=alanine, T=threonine, C=cysteine, Q=glutamine, F=phenylalanine). Aмидный протон Glu 31 (на карте Q 31 NH) контактирует с αпротоном Cys 30 (на карте C 30 α-H), aмидный протон Phe 33 (на карте F 33 NH) контактирует с α-протоном Тhr 32 (на карте Т 32 α-H) 9
Многомерный, гомо- и гетероядерныый ЯМР 2 D-ЯМР: два времени 3 D-ЯМР: три времени 4 D-ЯМР: четыре времени 2 D NMR: Pa→Ea(t 1)→Ma→Da(t 2) 3 D NMR: Pa→Ea(t 1)→Ma→Eb(t 2)→Mb→Db(t 3) 4 D NMR: Pa→Ea(t 1)→Ma→Eb(t 2)→Mb→Ec(t 3)→Mc→Dc(t 4) A B Соотношения между последовательностями импульсов для записи 2 D, 3 D, 4 D ЯМР. Сокращения: P- подготовка; Е-эволюция; Mсмешение; D-детектирование (A) 3 D гетероядерный ЯМР окисленного глютеродоксина из Е. Coli. Белок обогащен 15 N (B) Двумерный спектр (b), как функция еще одной частоты (а). Многомерный спектр – Большая Советская Энциклопедия (от одной строчки до 60 томов) 10
11
ЯМР макромолекул в твердом состоянии Со спектроскопической точки зрения основное различие между ЯМР в растворе и ЯМР в твердом теле лежит в подвижности образца. В растворе линии ЯМР узкие (изотропное усреднение), тогда как в твердом состоянии линии широкие и как следствие этого сильно перекрываются (анизотропное усреднение). Эффекты усреднения содержат фактор (3 cos 2θ – 1), где θ угол между направлением магнитного поля Bo и осью вращения образца. Поэтому если же твердый образец физически вращать с высокой скоростью под углом 54. 74 о (при этом фактор усреднения обращаются в ноль, cos 2θ = 1/3), то усреднение становится как бы изотропным и линии сильно сужаются 13 C ЯМР спектр аминокислоты (глицин) в статическом состоянии. Тот же спектр при вращении образца под так называемым 'магическим углом' с частотой 2. 0 k. Hz. Тот же спектр при вращении образца под так называемым 'магическим углом' с частотой 7. 2 k. Hz. В настоящее время метод находится в стадии интенсивного развития и есть все основания ожидать определения в ближайшем будущем трехмерных структур белков с хорошим пространственным 12 разрешением.
Скачать презентацию Импульсная Фурье ЯМР спектроскопия Два типа приборов в
cacd719cea3c1d6306443d8101db7581.ppt