ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ПРАКТИКЕ Заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики Копылов Юрий Николаевич
Методы клинической иммунологии позволяют решать следующие задачи: • • • Выявлять дефект того или иного звена иммунной системы (врождённые и приобретённые иммунодефициты). Диагностировать аутоагрессию против нормальных компонентов организма (аутоиммунные заболевания) и избыточное накопление иммунных комплексов (болезни иммунных комплексов). Выявлять дисфункции, при которых в том или ином звене иммунитета развиваются признаки гиперфункции в ущерб функционированию Других звеньев (гипергаммаглобулинемия, болезнь тяжёлых цепей, миелома и др. ). Осуществлять контроль за эффективностью иммунодепрессивной или иммуностимулирующей терапии. Проводить типирование и подбор доноров при пересадке органов и контроль за проведением иммунодепрессивной терапии при трансплантациях. Проводить фенотипирование гемобластозов. Показатели иммунограммы распределяют на определенные группы, в зависимости от того, какое звено иммунитета они характеризуют.
Иммунные факторы защиты • антиген неспецифические (врождённые) • и антигенспецифические (приобретённые, адаптивные).
Состояние системы врожденного (неспецифического) иммунитета характеризуют: • клетки пограничных тканей (кожи, слизистых оболочки дыхательных путей, пищеварительного и урогенитального тракта); • резидентные клетки различных органов и тканей; • клетки крови; • эндотелиоциты и интима артерий; • количество нейтрофилов и моноцитов крови, • величина показателей оценки фагоцитоза, • уровень естественных киллеров и больших гранулярных лимфоцитов, • сывороточный титр комплемента, концентрация отдельных компонентов комплемента в сыворотке крови, • концентрация лизоцима в секретах
Фагоциты Полинуклеарные (нейтрофилы, эозинофилы) составляют первую линию защиты от проникновения в организм разнообразных бактерий, грибов и простейших Мононуклеарные (моноциты, макрофаги) уничтожают повреждённые и погибшие клетки, участвуют в процессе удаления старых эритроцитов и очистки раневой поверхности Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов • Фагоцитарное число: норма — 5 10 микробных частиц. (Фагоцитарное число — среднее • • количество микробов, поглощённых одним нейтрофилом крови. Характеризует поглотительную способность нейтрофилов. ) Фагоцитарная ёмкость крови: норма — 12, 5— 25 х109 на 1 л крови. Фагоцитарная ёмкость крови — количество микробов, которое могут поглотить нейтрофилы 1 л крови. Фагоцитарный показатель: норма 65 95%. Фагоцитарный показатель относительное количество нейтрофилов (выраженное в процентах), участвующих в фагоцитозе. Количество активных фагоцитов: норма — 1, 6— 5, 0 х109 в 1 л крови. Количество активных фагоцитов — абсолютное количество фагоцитирующих нейтрофилов в 1 л крови. Индекс завершённости фагоцитоза: норма — более 1. Индекс завершенности фагоцитоза отражает переваривающую способность фагоцитов.
СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА 9 последовательно активирующихся компонентов и 3 ингибитора Одновременное определение 3 показателей — СЗ, С 4 компонентов и титра комплементной активности позволяет оценить состояние как классического, так и альтернативного путей активации Титр комплементной активности в сыворотке крови В норме титр комплементой активности в сыворотке крови у взрослых составляет 50 140 ЕД/мл. Титр комплемента в сыворотке крови оценивает активность терминальных компонентов комплемента при его активации по классическому и альтернативному пути. СЗ компонент комплемента в сыворотке крови Референтные величины содержания СЗ в сыворотке крови — 0, 55 1, 2 г/л. С 3 — ключевой компонент комплемента, необходимый для реализации цитолиза. Он синтезируется в печени и входит в состав образующихся им мунных комплексов. СЗ активируется по классическому пути комплексами Аг с Ig. G, Ig. M, по альтернативному пути — комплексами Аг с Ig. A, Ig. E, Fab фрагментами Ig, полисахаридными Аг бактерий. С 4 компонент комплемента в сыворотке крови Референтные величины содержания С 4 в сыворотке крови — 0, 2 0, 5 г/л. С 4 — компонент классического пути активации комплемент
NK ЛИМФОЦИТЫ (CD 16) В КРОВИ В норме количество СВ 16 лимфоцитов в крови у взрослых составляет 6 26%. NK клетки (СD 16 лимфоциты) — клетки эффекторы, ответственные за противоопухолевый, противовирусный и трансплантационный иммунитет. NK клетки отдельная популяция лимфоцитов, они отличаются от Т и В лимфоцитов как по происхождению, так и по функциональным свойствам и поверхностным рецепторам (у человека существуют 2 субпопуляции — CD 16 и CD 56). Они обладают спонтанной цитотоксической активностью против различных опухолевых клеток, инфицированных вирусами, и некоторых нормальных клеток, обеспечивая первый уровень защиты против опухолей и внутриклеточных инфекций до включения специфических иммунных механизмов
Антигенспецифические факторы включают гуморальный и клеточный иммунный ответ • КЛЕТОЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ основан на действии активированных тимусзависимых лимфоцитов (Т лимфоцитов). Клеточный тип ответа характеризуется выработкой большого количества антигенспецифических активированных В и Т лимфоцитов. Оптимальный иммунный ответ реализуется только при взаимодействии гуморального и клеточного звеньев иммунитета. Клеточный иммунитет представлен различными популяциями Т и В лимфоцитов, соотношение которых играет важную роль для оценки состояния этого звена иммунитета. • ГУМОРАЛЬНЫЙ ОТВЕТ основан на выработке AT, Для иммунного ответа гуморального типа характерна выработка AT, которые одновременно являются эффекторами В звена иммунной системы. Для оценки этого звена используются исследования, которые характеризуют функциональную активность В звена иммунитета и включают в себя определение концентраций Ig, уровня AT после профилактической иммунизации, выявление ЦИК.
Клеточный иммунитет • • • Клеточное звено иммунитета характеризуют содержание : CD 3+ Т лимфоцитов (интегральный показатель клеточного звена), CD 3+CD 4+ Т лимфоцитов (так называемых Т хелперов), CD 3+CD 8+ Т лимфоцитов (так называемых Т киллеров, или цитотоксических Т лимфоцитов), CD 4+CD 25+ Т лимфоцитов (регуляторных Т клеток), CD 3+CD 16+CD 56+клеток (естественных киллерных Т лимфоцитов). Клеточное звено является превалирующим при вирусных, грибковых патогенах, атипичных возбудителях (микоплазмы, хламидии), бактериальных инфекциях с внутриклеточным пребыванием возбудителя (микобактерии), а также при иммунном ответе на опухоли и тканевые формы гельминтов (например, личинки аскариды или трихинеллы).
ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО Т ЛИМФОЦИТОВ (CD 3) В КРОВИ В норме относительное общее количество Т лимфоцитов в крови у взрослых составляет 58 76%, абсолютное количество — 1, 1 1, 7 х109/л. Т ЛИМФОЦИТЫ ХЕЛПЕРЫ (CD 4) В КРОВИ В норме относительно количество Т лимфоцитов хелперов в крови у взрослых составляет 36 55%, абсолютное количество — 0, 4 1, 1 х109/л. Т ЛИМФОЦИТЫ СУПРЕССОРЫ (CD 8) В КРОВИ В норме относительное количество Т лимфоцитов супрессоров в крови у взрослых составляет 17 37%, абсолютное количество — 0, 3 0, 7 x 10 9/л Т ЛИМФОЦИТЫ С РЕЦЕПТОРАМИ К ИНТЕРЛЕЙКИНУ 2 (CD 25) В КРОВИ В норме количество СД 25 лимфоцитов в крови у взрослых составляет 13 24% NK ЛИМФОЦИТЫ (CD 16) В КРОВИ В норме количество СВ 16 лимфоцитов в крови у взрослых составляет 6 26%. NК ЛИМФОЦИТЫ (CD 56) В КРОВИ В норме количество СD 56 лимфоцитов в крови у взрослых составляет 9 19%.
Гуморальный иммунитет • • Гуморальное звено иммунитета характеризуют : уровни иммуноглобулинов разных классов (Ig. М, Ig. G, Ig. E, сывороточного и секреторного Ig. A). уровни CD 3 CD 19+, CD 3 CD 20+, CD 3 CD 21+ и CD 3 CD 22+ клеток (В лимфоцитов в разные фазы созревания), Поскольку синтез антител является Т зависимым процессом, для надлежащей оценки гуморального звена иммунитета следует учитывать уровень Т хелперов (CD 3+СD 4+ Т лимфоцитов), что еще раз подтверждает целесообразность комплексного подхода к интерпретации иммунограммы. Гуморальное звено является преобладающим при бактериальных инфекциях с внеклеточным пребыванием патогена (стрептококки, стафилококки, эшерихии, синегнойная палочка, протей и др. ), а также при полостных протозойных и гельминтных инвазиях
ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО В ЛИМФОЦИТОВ (CD 20) В КРОВИ Общее количество CD 20 лимфоцитов в крови для взрослых в норме составляет 8 19%, абсолютные значения — 0, 19 0, 38 х109/л АКТИВИРОВАННЫЕ В ЛИМФОЦИТЫ (CD 23) В КРОВИ Нормальное количество СD 23 лимфоцитов в крови у взрослых составляет 6 12% В ЛИМФОЦИТЫ, НЕСУЩИЕ Ig. A, В КРОВИ Нормальное относительное количество В лимфоцитов, несущих Ig. A, в кро ви у взрослых составляет 1 3%, абсолютное количество — 0, 02 0, 06 х109/л. В ЛИМФОЦИТЫ, НЕСУЩИЕ Ig. M, В КРОВИ В норме относительное количество В лимфоцитов, несущих Ig. M, в крови у взрослых составляет 3 10%, абсолютное количество — 0, 07 0, 17 x 109/л В ЛИМФОЦИТЫ, НЕСУЩИЕ Ig. G, В КРОВИ В норме относительное количество В лимфоцитов, несущих Ig. G, в крови у взрослых составляет 2 6%, абсолютное количество — 0, 04 0, 11 х109/л.
Схема строения иммуноглобулинов 5 классов (Р. М. Хаитов с соавт. , 2000) 1 – углеводные компоненты молекул иммуноглобулинов, 2 – J цепь – дополнительная полипептидная цепь, связывающая Ig. M в пентамер, Ig. Aв димер.
Ig. G реализуют антивирусные, антитоксические, антибактериальные действия. Только эти иммуноглобулины могут приникать через плаценту и ответственны за защиту новорожденного, активируют комплемент и присоединяются к макрофагам Ig. A преобладают во всех секретируемых жидкостях, таких как слюна, назальные и респираторные секреты, грудное молоко, вагинальные секреты. Защищают слизистые оболочки. Ig. M формируют натуральные антитела, такие как, например, антитела к антигенам АВО крови. Участвуют в раннем иммунном ответе. Активируют комплемент Ig. D находятся на В лимфоцитах. Необходимы для созревания В клеток Ig. E –присоединяются к тучным клеткам и базофилам. Участвуют в противопаразитарных, инфекционных, аллергических реакциях и реакциях гиперчувствительности
= нт ме г ра ф Fc фрагмент b Fa
Скорость развития первичного и вторичного иммунного ответа
Иммунофенотипирование клеток (CD-маркерный анализ) • Каждой стадии дифференцировки гемопоэтических клеток соответствует свой набор Аг, которые по международной классификации называются дифференцировочными и разделяются на кластеры дифференцировки, обозначаемые CD
Значительный прогресс в гематологических исследованиях связан в последние годы с использованием современных иммунологических методов и автоматизированных средств анализа и сортировки клеток периферической крови и костного мозга — проточных цитометров.
• Принцип работы оптического счетчика частиц • Устройство кондуктометрической измерительной камеры для подсчета клеток с использованием гидродинамической фокусировки В момент пересечения луча клеткой происходит поглощение и рассеяние света, которое обусловлено клеточным размером, формой, плотностью, окрашиванием и гранулярностью внутриклеточных структур
ИСТОРИЯ БОЛЕЗНИ Девочка 6 лет поступила в клинику с жалобами на постоянный озноб. Объективно – увеличение лимфоузлов и гепатоспленомегалия. В анализе крови – 31. 0 тысяча лейкоцитов в мкл с 75% бластных клеток. В миелограмме костного мозга >80% бластных клеток. Большинство бластных клеток (приблизительно 65 %) были B клетками, поскольку содержали макёры CD 19 и CD 20, но не CD 21. Присутствуют маркеры CD 10 и CIg, , но не CIg, что указывает на пре. В стадию дифференцировки лимфоцитов. Этот лейкоз известен как пре. B клеточный острый лимфообластный лейкоз.
Исследование онкомаркеров • К маркёрам злокачественного роста относятся вещества разной природы: Аг, гормоны, ферменты, гликопротеины, липиды, белки, метаболиты. Синтез маркёров обусловлен особенностями метаболизма раковой клетки, нормальная экспрессия генома — один из основных механизмов продукции маркёров опухолевыми клетками, который обусловливает синтез эмбриональных, плацентарных и эктопических ферментов, Аг и гормонов. • Известен широкий спектр маркёров при различных локализациях рака, однако лишь единичные могут в какой то мере соответствовать понятию «идеальный маркёр» .
Раковый антиген СА-125 в сыворотке крови • • • Референтные величины СА 125 у женщин в сыворотке до 35 МЕ/мл; при беременности — до 100 МЕ/мл; у мужчин — до 10 МЕ/мл. Период полужизни 4 дня. СА 125 — гликопротеин, присутствующий в серозных оболочках и тканях. У женщин детородного возраста основным источником СА 125 является эндометрий, с чем связано циклическое изменение уровня СА 125 в крови в зависимости от фазы менструального цикла. В период менструации концентрация СА 125 в крови повышается. У здоровых женщин на уровень СА 125 в крови оказывает влияние синтез этого маркёра в мезотелии брюшной и плевральной полостей, перикарде, эпителии бронхов, маточных труб, яичников, У мужчин (в дополнение к серозным полостям) – синтезируется в эпителии семенников. Определение содержания СА 125 в сыворотке применяют: для диагностики рецидивов рака яичника; для мониторинга лечения и контроля течения рака яичников; для диагностики новообразований брюшины, плевры; для диагностики серозного выпота в полости (перитонит, плеврит): для диагностики эндометриоза.
Простатический специфический антиген в сыворотке крови (ПСА) • Референтные величины ПСА в сыворотке крови: мужчины до 40 лет до 2, 5 нг/мл, после 40 лет — до 4 нг/мл. Период полужизни — 2 3 дня. • • • ПСА — гликопротеид, выделяемый клетками эпителия канальцев предстательной железы. В связи с тем что ПСА образуется в парауретральных железах, только очень малые количества его могут обнаруживаться у женщин. Значительное повышение уровня ПСА в сыворотке иногда обнаруживается при гипертрофии предстательной железы, а также при воспалительных её заболеваниях. При точке разделения 10 нг/мл специфичность по отношению к доброкачественным заболеваниям предстательной железы составляет 90%. Концентрация ПСА имеет тенденцию к увеличению с возрастом, поэтому понятие «допустимой верхней границы нормы» для разных возрастных групп различно Исследование ПСА применяют для диагностики и мониторинга лечения рака предстательной железы, при котором его концентрация увеличивается, а также для мониторинга состояния пациентов с гипертрофией простаты в целях как можно более раннего обнаружения рака этого органа.
Краткий перечень онкомаркёров • S 10, TA 90 онкомаркеры рака кожи (меланома) Как правило, уровень выше, если есть метастазы. • Бета 2 микроглобулин (B 2 M) повышается при множественной миеломе и некоторых видах опухолей костного мозга и кроветворной системы. • СA 15 3, CA 27. 29 изначально – маркеры рака молочных желез. На ранних стадиях повышение незначительно (менее 10 %). При развитии маркер повышается на 75%. Не исключено повышение этих маркеров и при других опухолях. • Карциноидоэмбриональный антиген (CEA) маркер рака прямой кишки, но используют в оценке рака молочных желез, легких, мочевого пузыря, шейки матки, поджелудочной железы. Данный маркер неспецифический. Значение выше 5 ЕД/мл не нормальный уровень. • Альфа фетопротеин (AFP) повышение у людей с раком печени (гепатоцеллюлярный рак). Норма менее 20 нг/мл Уровень AFP увеличивается с ростом опухоли. Кроме этого, AFP может повышаться при острых и хронических гепатитах (редко больше 100 нг/мл), некоторых видах раков яичников и яичек (около 5%). • CA 19 9 – маркер, показывает рак поджелудочной, чаще используют для контроля лечения. Высокий уровень показатель выше 37 ЕД/мл. Также, возможно повышение при раке желчных проходов, некоторых видах рака кишечника. • Хромогранин А его продуцируют опухоли, которые исходят из клеток эндокринной и нервной систем. Сывороточный гаммаглобулин часто обнаруживают при опухолях костного мозга (макроглобулинемия, множественная миелома). • Человеческий хорионический гонадотропин (ЧХГ, HCG) можно обнаружить при некоторых опухолях средостенья. • NMP 22 специфический белок, при раке мочевого пузыря. Чаще всего для контроля эффективности лечения, вместо цистоскопии. • Нейрон специфическая энолаза (NSE) в ряде случаев используют в оценке состояния при раке легких и опухолями, исходящими из эндокринной и нервной ткани. • Тканевой полипептидный антиген (TPA) маркер рака легких. • И другие …
Схема назначения исследований онкомаркёров 1. Определить уровень онкомаркёра перед лечением и в дальнейшем исследовать те онкомаркёры, которые были повышены. 2. После курса лечения (операции) исследовать через 2 10 дней (соответственно периоду полужизни маркёра) с целью установления исходного уровня для дальнейшего мониторинга. 3. Для оценки эффективности лечения (операции) провести исследование спустя 1 мес. 4. Дальнейшее изучение уровня онкомаркёра в крови проводить 1 раз в месяц в течение 1 го года после лечения, 1 раз в 2 месяца в течение 2 го года после лечения, 1 раз в 3 месяца в течение 3 5 лет (рекомендации ВОЗ). 5. Проводить исследование онкомаркёра перед любым изменением лечения. 6. Определять уровень онкомаркёра при подозрении на рецидив и метастазирование. 7. Определять уровень онкомаркёра через 3 4 нед после первого выявления его повышения.
ИММУНО ФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ АНАЛИТИЧЕСКИЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МОЛЕКУЛ, ОСНОВАННЫЙ НА ПРИМЕНЕНИИ РЕАКЦИИ АНТИГЕН АНТИТЕЛО И ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ СПЕЦИФИЧНОСТЬ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ИСКЛЮЧИТЕЛЬНО ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ РЕАКЦИИ АНТИГЕН АНТИТЕЛО ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ИСКЛЮЧИТЕЛЬНО ВЫСОКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА РЕГИСТРАЦИИ РЕАКЦИИ
РЕАКЦИЯ АНТИГЕН АНТИТЕЛО Специфичность реакции антиген антитело определяется большим числом центров взаимодействия, расположенных комплиментарно по отношению друг к другу
А Н Т И Т Е Л А АНТИГЕН АНТИТЕЛА К РАЗЛИЧНЫМ ДЕТЕРМИНАНТАМ АНТИГЕНА Антиген имеет несколько детерминантов, к которым образуются специфические антитела. Число детерминантов зависит от размера и структуры антигена.
ПОЛИКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА АНТИГЕН Антитела, комплиментарные к различным детерминантам антигена. Образуются при иммунизации организма животного и человека.
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА Антитела, комплиментарные к определенному детерминанту антигена АНТИГЕН Детерминанты антигена
СХЕМА НЕКОНКУРНТНОГО МЕТОДА ИФА ТИПА «СЕНДВИЧ» 1. Специфическая сорбция антигенов на активированную поверхность. 2. Специфическая сорбция антител, меченных ферментом на сорбированные антигены. 3. Стадия ферментативной реакции 4. Фотометрическая регистрация ферментативной реакции. Антиген должен иметь не мене двух детерминантов.
СХЕМА НЕКОНКУРНТНОГО МЕТОДА ИФА ТИПА «СЕНДВИЧ» 1 й этап. Специфическая сорбция антигенов на активированную поверхность. Активиро ванная к антителам поверхность Антиген Антитело, специфичное к детерминанту антигена Нейтральный белок Антигены из раствора селективно сорбируются на антителах на поверхности.
СХЕМА НЕКОНКУРНТНОГО МЕТОДА ИФА ТИПА «СЕНДВИЧ» 2 й этап. Специфическая сорбция антител, меченных ферментом на сорбированные антигены. Активиро ванная к антителам поверхность Антиген Антитело Нейтральный белок Антитело, специфическое к детерминанту антигена, меченное ферментом
СХЕМА НЕКОНКУРНТНОГО МЕТОДА ИФА ТИПА «СЕНДВИЧ» 3 й этап. Стадия ферментативной реакции Антиген Активиро ванная к антителам поверхность Антитело Нейтральный белок Атитело, меченное ферментом
СХЕМА НЕКОНКУРНТНОГО МЕТОДА ИФА ТИПА «СЕНДВИЧ» 4 й этап. Фотометрическая регистрация ферментативной реакции Активиро ванная к антителам поверхность В результате ферментативной реакции образуется окрашенный раствор.
СХЕМА КОНКУРНТНОГО МЕТОДА ИФА 1. Специфическая конкурентная сорбция регистрируемых антигенов и антигенов, меченных ферментом на активированную поверхность. 2. Стадия ферментативной реакции 3. Фотометрическая регистрация ферментативной реакции. Применяется в первую очередь для регистрации относительно небольших молекул: гармонов, лекарств и пр.
СХЕМА КОНКУРНТНОГО МЕТОДА ИФА Специфическая конкурентная сорбция антигенов пробы и антигенов, меченных ферментом. Активиро ванная к антителам поверхность Антиген пробы Антиген, меченный ферментом Антитело Нейтральный белок
О П Т И Ч Е С К А Я КАЛИБРОВКА ИФА МЕТОДА П Л О Т Н О С Т Ь КОНЦЕНТРАЦИЯ НЕКОНКУРЕНТНЫЙ МЕТОД
Благодарю за внимание !
Скачать презентацию ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ПРАКТИКЕ Заведующий кафедрой
0df60828b2956e332c42d66a7b389da8.ppt