Иммуноферментный анализ в диагностике ООИ

Иммуноферментный анализ в диагностике ООИ П. Н. Дерябин

Метод иммуноферментного анализа (ИФА) был предложен в начале 70 -х годов тремя группами исследователей: - Engvall и Perlmann в Швеции, - van Weemen и Schuur в Нидерландах - - Rubenstein с сотр. в США. К концу ХХ века этот метод прошел путь от новейшей научной разработки до рутинного метода в клинической диагностике.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА) основывается на двух принципиальных научных открытиях: первое заключается в способности энзимов и антител, ковалентно или нековалентно связанных с твердой основой, сохранять свою функциональную активность, т. е. расщеплять субстрат (ферменты) и связывать антигены/антитела; второе базируется на создании комплекса антитело-фермент (Аb-F) в виде конъюгата, сохраняющего свою биологическую активность в растворе. Аb-F-конъюгаты характеризуются высочайшей специфичностью и чувствительностью, достигающей 97 -99%.

Существует несколько модификаций ИФА: 1. ELISA (enzyme linked immunoadsorbent assay) - метод определения с помощью иммуносорбентов, связанных с ферментами; 2. EIA (enzyme immunoassay) - метод на основе фермент-иммуноопределения; 3. EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique) - способ, основанный на связи с ферментами. Первые две модификации (ELISA и EIA) - это методы гетерогенного или твердофазного анализа (т. ИФА), а третья разновидность (EMIT) является гомогенным ИФА.

Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами выявления антигенов и антител обладает следующими преимуществами: высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0, 05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата; возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала; стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более); простотой проведения реакции; наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета; возможностью автоматизации всех этапов реакции; экологической чистотой и безопасностью для мед. персонала (в отличии от РИА); относительно низкой стоимостью диагностических наборов.

Основные характеристики ИФА Высокая чувствительность – 97 -99% Высокая специфичность – 95 -97% Объективный учет результатов, стандартизация метода Воспроизводимость результатов

Диагностические возможности метода Диагностика этиологических агентов заболевания (антигенов) Определение активности (титра) антител и их классовой принадлежности (Ig A, M, G) для дифференциальной диагностики острой и хронической инфекции острой и хронической инфекции Расширение возможностей лабораторной диагностики - определение цитокинов, гормонов Принцип ИФА внедряется для оценки результатов (визуализации) гибридизации при ПЦР - диагностике

Технические преимущества ИФА - диагностики Техническая простота выполнения Малое время анализа Возможность автоматизации, не исключающая работу практически без оборудования Возможность проведения как большого объема исследований, так и малого количества анализов (до 5 проб)

Другие преимущества (режимные условия) Не требуются специальные помещения (боксы) Не требуется создания стерильности Нет повышенных требований к оборудованию помещений, разделения производственных комнат

Виды антигенов, используемых в ИФА Лизатные - разработанные на основе нативного антигена, лизированного или обработанного ультрозвуком Рекомбинантные - использующие в качестве антигена полученные генно-инженерным способом белки, исключающие кросс- реагирование Пептидные – использующие химически сиснтезированные аналоги белков.

Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным. Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог любого отдельного антигена. Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы высокоиммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам в достаточно большом количестве) и высокоспецифичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и не дающими перекрёстных реакций с антителами другой природы). Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100%-ной специфичностью при высокой чувствительности. На практике этого не всегда удаётся достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.

Требования к рекомбинантным антигенам Высоко иммуногенные; Высоко специфичные, не дающие перекрестных реакций; Антитела к антигенам выявляются в течение всего заболевания.

Пептидные антигены Высокая специфичность; Снижение биологической опасности производстве наборов и их использовании.

Ни один лабораторный метод не обеспечивает 100% чувствительность и специфичность Грамотная постановка диагноза обеспечивается совокупностью: • Клинического обследования • Эпидемиологического анамнеза • Лабораторных исследований

Направления использования ИФА Скрининговые исследования Диагностические исследования Референс – исследования для распознавания неспецифических результатов

Понятие «серой зоны» «Серая зона» - сомнительные результаты, требующие дополнительных исследований Интервал значений критической оптической плотности в пределах 10% отрицательные < 90% положительные > 110%

Коэффициент позитивности Соотношение оптической плотности образца к критической оптической плотности КП = ОП образца / ОП крит Целесообразно использовать при наблюдении за динамикой процесса и при оценке эффективности лечения.

Принцип ИФА Взаимодействие антигена и антитела Создание комплекса АГ/АТ и коньюгата Определение образовавшегося комплекса с помощью субстратной смеси по степени окраски

Определение Ab методом твердофазного иммуноферментного анализа

Определение Ag методом твердофазного иммуноферментного анализа

Конкурентный ИФА