Иммобилизованные клетки и ферменты, их использование в различных отраслях науки и производства С. Е. ДРОМАШКО Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Беларусь, Минск 220072, ул. Академическая, 27, тел. : +375(17)284 -21 -90, e-mail: S. Dromashko@igc. bas-net. by
Общие принципы иммобилизации и характеристика носителей Что такое вообще иммобилизованные клетки? Иммобилизованными называют такие клетки, для которых созданы искусственные ограничения подвижности во внешней среде, а материальный посредник, обеспечивающий эти ограничения подвижности, считается носителем. В целом система клетка–носитель называется иммобилизованным биокатализатором. Проблема использования ферментативной активности иммобилизованных микроорганизмов имеет глубокие корни. Более 150 лет назад быстрый способ получения уксуса был основан на применении микроорганизмов, адсорбированных на древесной стружке. В 70 -х годах XX в. появились первые научные публикации об иммобилизации клеток микроорганизмов, а первое промышленное применение иммобилизованных клеток было осуществлено в Японии в 1974 г. С их помощью получали аспарагиновую кислоту.
Общие принципы иммобилизации и характеристика носителей Существуют по меньшей мере четыре области, в которых могут найти применение иммобилизованные ферменты и клетки, а именно: промышленность, охрана окружающей среды, различные анализы и производство лекарственных препаратов. Примерами первой области являются синтез аминокислот, антибиотиков, трансформация стероидов, производство сахарных сиропов и молочных продуктов. К применениям для охраны окружающей среды относятся обработка сточных вод и гидролиз городских, промышленных и сельскохозяйственных стоков, содержащих целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин. Помимо того что эти процессы имеют социальное значение, они выгодны с экономической точки зрения, так как при этом утилизируется энергия в форме метана или этанола.
Общие принципы иммобилизации и характеристика носителей Использование иммобилизованных клеток позволяет избежать необходимости выделения и очистки требуемых ферментов. Более того, поскольку ферменты функционируют в нативном окружении, их денатурация в процессе работы сводится к минимуму. Еще одним преимуществом использования клеток является также возможность регенерации кофакторов в подходящих условиях. Это расширяет число применяемых ферментов и позволяет осуществлять как процессы синтеза, так и процессы деградации. Кроме того, появляется возможность протекания многостадийных (т. е. последовательных) ферментативных реакций.
Общие принципы иммобилизации и характеристика носителей Конечно, использование иммобилизованных клеток не лишено недостатков; при этом исследователи сталкиваются с рядом трудностей. Так, например, клеточная стенка, плазматическая или внутриклеточная мембрана могут препятствовать проникновению субстрата к соответствующему ферменту, а также диффузии продукта из клетки. Кроме того, возникает необходимость поддержания целостности клетки и удержания клеток в той фазе роста, в которой синтезируются требуемые ферменты. Наконец, из-за большого числа присутствующих в клетке ферментов (что в ряде случаев рассматривается как достоинство) возможно протекание нежелательных побочных реакций.
Общие принципы иммобилизации и характеристика носителей Итак, можно подытожить, что иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ как перед иммобилизованными ферментами, так и перед свободными клетками, а именно: • отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов; • снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции; • более высокая активность и стабильность; • возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов; • способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов.
Общие принципы иммобилизации и характеристика носителей Для иммобилизации могут быть использованы клетки в различном состоянии: живые и поврежденные в той или иной степени. Одностадийные реакции могут осуществлять и живые, и поврежденные клетки. Полиферментные реакции проводят с применением живых клеток, которые могут длительное время регенерировать АТФ и коферменты (НАДФ, НАД). Различают два направления в исследованиях по иммобилизованным микроорганизмам: § создание катализаторов процессов биотрансформации различных органических соединений; § создание катализаторов для реализации процессов биосинтеза различных органических соединений, в том числе первичных и вторичных метаболитов.
Общие принципы иммобилизации и характеристика носителей В зависимости от типа клеток и решаемых задач различают следующие виды иммобилизации: § на поверхности носителя; § в массе носителя; § в полимерном геле; § в полимерных пленках; § с использованием мембранных технологий; § с помощью плоских мембран; § с использованием пористых и полых волокон; § с применением микрокапсулирования.
Общие принципы иммобилизации и характеристика носителей Иммобилизация клеток путем включения в различные гели, мембраны, волокна основана на химических и физических взаимодействиях. Химический метод основан на образовании ковалентных связей с активированным носителем, на поперечной сшивке клеток за счет активных групп в клеточной оболочке с бифункциональными реагентами (например, глутаровым альдегидом). К физическим методам относятся адсорбция и агрегация. Химические методы используются реже по сравнению с другими методами и малопригодны для иммобилизации живых клеток. Гораздо большее распространение получило включение клеток в состав гелей, мембран и волокон. При таком способе иммобилизации клетки могут сохранять жизнеспособность и в присутствии питательной среды размножаться в приповерхностных слоях гелей.
Общие принципы иммобилизации и характеристика носителей Наибольшее количество исследований по иммобилизации клеток микроорганизмов проведено японскими исследователями. Особые успехи были достигнуты ими в области синтеза аминокислот, органических кислот и антибиотиков. В Московском государственном университете был разработан метод получения аспарагиновой кислоты, который по эффективности не уступает японским. Клетки E. coli, включенные в армированный полиакриламидный гель, были с успехом использованы для получения аспарагиновой кислоты, период полужизни катализатора – 110 суток. Иммобилизовать можно не только клетки микроорганизмов, но и клетки растительных и животных тканей, используя их для синтеза физиологически активных соединений.
Характеристика иммобилизованных биокатализаторов По принципу действия все искусственные твердофазные биокатализаторы на основе микробных клеток разделяются на 4 типа: 1. Одноферментные системы без кофакторов. 2. Олигоферментные системы регенерацией разных кофакторов (обычно НАД и НАДН). 3. Мультиферментные системы с регенерацией нескольких кофакторов. 4. Мультиферментные системы, катализирующие сложные сиснтетические процессы, непосредственно связанные с основным метаболизмом клетки.
Характеристика иммобилизованных биокатализаторов Методы иммобилизации клеток делят на 4 категории: 1. Иммобилизация клеток или субклеточных органелл в инертном субстрате. Например, клетки Catharanthus roseus, Digitalis lanata в альгинатных, агарозных шариках, в желатине и т. д. Метод предполагает обволакивание клеток одной из различных цементирующих сред – альгинат, агар, коллаген, полиакриламид. 2. Адсорбция клеток на инертном субстрате. Клетки прилипают к заряженным шарикам из альгината, полистирола, полиакриламида. Метод применялся в экспериментах с животными клетками, а также клетками Saccharomyces uvarum, S. cerevisiae, Candida tropicalis, E. coli. 3. Адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических макромолекул (таких, как лектин). Применяется редко, есть сведения об экспериментах с различными линиями клеток человека, эритроцитами крови барана, адсорбированными на покрытой белком агарозе. 4. Ковалентное связывание с другим инертным носителем типа КМЦ. Очень редко применяется, известна удачная иммобилизация для Micrococcus luteus. В основном проводились эксперименты по иммобилизации клеток животных и микроорганизмов.
Конструкции реакторов За исключением некоторых специальных случаев, чаще всего гель, в который включают клетки, состоит из сферических частиц, а не из волокна, мембран или блоков. Одностадийные биопревращения с использованием иммобилизованных ферментов или мертвых клеток осуществляют обычно (1) в проточных реакторах с перемешиванием, (2) в реакторах с псевдоожиженным слоем или (3) в реакторах с полыми волокнами. Каждая из этих систем имеет определенные ограничения в отношении величин перепадов давления и неравномерного распределения катализатора.
Конструкции реакторов Типы реакторов. В реакторе с перемешиванием можно использовать магнитную или подвесную мешалку. Модифицированный реактор колоночного типа предназначен для работы с препаратами иммобилизованных клеток, которые образуют газообразные продукты.
Конструкции реакторов Для увеличения площади поверхности и, следовательно, улучшения диффузии (которая в одностадийных реакциях является лимитирующим фактором) применяют малые сферические частицы одинакового размера. Однако, при этом увеличивается перепад давления по длине колонки. Если используют иммобилизованные живые клетки, критическим фактором является диффузия газов, а не других компонентов реакции. Газ, выделяемый живыми клетками, может захватываться шариками, вызывая их всплывание и тем самым снижая их каталитическую активность. В этом случае не следует применять стандартный реактор колоночного типа, так как под давлением выделяющегося газа он может разрушиться.
Конструкции реакторов Чтобы избежать этого, реактор нужно модифицировать, как показано на рисунке. На расстоянии 2– 4 см ниже выпускного патрубка реактора устанавливают металлическую сетку. Ее либо плотно вставляют в реактор, либо удерживают тремя-четырьмя металлическими удлинителями, упирающимися в верхнюю крышку реактора и не дающими сетке подняться. Реактор с перемешиванием, который можно использовать в непрерывном (проточном) режиме, более предпочтителен для проведения рутинных исследований в малом масштабе. Однако его производительность невелика, особенно если работать с большими объемами субстрата. Следует также помнить о возможности разрушения частиц геля при перемешивании. Во всех случаях рекомендуется проводить предварительное исследование с использованием непроточного реактора с перемешиванием, который легко сконструировать в обычной лаборатории.
Физиолого-биохимические особенности иммобилизованных биокатализаторов, их практическое использование Выбор способа иммобилизации микробных клеток определяется как физиолого-биохимическими особенностями иммобилизованных биокатализаторов, так и стоящими перед исследователем или производственником задачами и осуществляется: 1. По принципу действия иммобилизованных клеточных систем (так наибольший прогресс отмечается в использовании иммобилизованных клеток катализаторов биотрансформации). 2. По масштабам биотехнологического процесса (для проведения процессов «большой» биотехнологии, т. е. крупнотоннажного производства таких продуктов, как аминокислоты, органические кислоты, спирты и т. д. ). 3. По специфике биотехнологического процесса (для очистки сточных вод в биофильтрах – только адсорбционный метод).
Физиолого-биохимические особенности иммобилизованных биокатализаторов, их практическое использование Биокаталитическая активность целых иммобилизованных клеток в настоящее время может быть использована в различных отраслях науки и техники: § при биосинтезе и трансформации таких соединений, как аминокислоты, органические кислоты, антибиотики, стероиды углеводы, углеводороды, нуклеотиды и нуклеозиды; § в пивоварении и виноделии; § при очистке сточных и природных вод; § при извлечении металлов из сточных вод; § в биогеотехнологии; § при ассимиляции солнечной энергии; § при изготовлении водородных солнечных элементов; § в азотфиксации; § в аналитических целях при изготовлении биоселективных электродов.
Биомедицинское применение искусственных препаратов, содержащих иммобилизованные ферменты, белки, клетки и другие биологически активные материалы Применение ферментов и других физиологически активных веществ (ФАВ) белковой природы в терапии имеет давние традиции. Современная медицина все шире использует высокоочищенные препараты ФАВ белковой природы в самых различных отраслях клинической медицины в качестве перспективных средств медикаментозного лечения вследствие их исключительно высокой активности и специфичности. В настоящее время наметились следующие основные направления энзимотерапии: 1) устранение дефицита ферментов с целью компенсации врожденной или приобретенной функциональной недостаточности; 2) удаление нежизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых осколков; 3) лизис тромбов; 4) комплексная терапия злокачественных новообразований; 5) детоксикация организма.
Биомедицинское применение искусственных препаратов, содержащих иммобилизованные ферменты, белки, клетки и другие биологически активные материалы В настоящее время принято выделять два принципиальных подхода к получению иммобилизованных терапевтических ферментов. 1. При различных системных поражениях, когда присутствие терапевтического фермента необходимо в разных органах и тканях, целесообразно использовать тем или иным способом стабилизированные водорастворимые препараты иммобилизованных ферментов, обладающие повышенной стабильностью в физиологических условиях и замедленным выведением из организма. Сюда же будут относиться и различные ферментсодержащие искусственные клетки типа микрокапсул, теней эритроцитов или липосом.
Биомедицинское применение искусственных препаратов, содержащих иммобилизованные ферменты, белки, клетки и другие биологически активные материалы 2. С другой стороны, для терапии локальных поражений, когда присутствие фермента требуется лишь в месте поражения, целесообразно создание биосовместимых ферментсодержащих полимерных частиц, которые могут быть локализованы в определенном месте и оставаться там заданное время, непрерывно выделяя в окружающую среду терапевтический фермент, предпочтительно дополнительно стабилизированный. Самостоятельный случай – использование иммобилизованных ферментов в аппаратах для экстракорпоральной перфузии типа искусственной почки, в перевязочных и дренирующих материалах для ускорения заживления ран и ожогов и для модификации внутренней поверхности протезов кровеносных сосудов с целью понижения тромбообразования.
Биомедицинское применение искусственных препаратов, содержащих иммобилизованные ферменты, белки, клетки и другие биологически активные материалы Стабилизация терапевтических ферментов в ряде случаев может осуществляться без использования полимерных носителей, просто за счет целенаправленной химической модификации белковой глобулы низкомолекулярными реагентами или за счет введения в глобулу внутримолекулярных скобок из бифункциональных реагентов, затрудняющих денатурационное разворачивание молекулы белка. Этот подход особенно важен, если терапевтический фермент для осуществления своей функции должен провзаимодействовать с рецептором клеточной мембраны (например, пара тромбин–тромбоцит) или проникнуть внутрь клетки (ферменты, применяемые для терапии многочисленных наследственных ферментных недостаточностей печени), а наличие полимерного носителя может резко снизить эффективность ферментного препарата.
Биомедицинское применение искусственных препаратов, содержащих иммобилизованные ферменты, белки, клетки и другие биологически активные материалы В ряде случаев применяют межмолекулярное сшивание ферментов бифункциональными реагентами типа глутарового альдегида, что можно также рассматривать как иммобилизацию одной молекулы фермента на другой. Такая модификация фермента приводит к повышению его стабильности и эффективности, например, таким образам удалось стабилизировать альфа-галактозидазу, применяемую для лечения болезни Фабри. Наиболее распространенным способам получения растворимых стабилизированных ферментных препаратов является их модификация растворимыми полимерами. Наиболее удобны в качестве носителей полисахариды, в частности декстраны, из-за их высокой биосовместимости.
Биомедицинское применение искусственных препаратов, содержащих иммобилизованные ферменты, белки, клетки и другие биологически активные материалы Определенные перспективы открывает использование в качестве носителей природных соединений, которые сами по себе обладают полезной физиологической активностью или способны усиливать действие связанного с ними фермента. Так, для иммобилизации тромболитических ферментов может использоваться антикоагулянт гепарин.
Биомедицинское применение искусственных препаратов, содержащих иммобилизованные ферменты, белки, клетки и другие биологически активные материалы Еще один перспективный метод применения модифицированных форм ферментов для лечения — это создание различного типа искусственных клеток. Исторически первым подходом к этой проблеме было микрокапсулирование ферментов, т. е. их включение в полимерные микрокапсулы, обеспечивающие надежное удержание и защиту фермента и свободное проникновение относительно низкомолекулярных субстратов и продуктов ферментативной реакции.
Биомедицинское применение искусственных препаратов, содержащих иммобилизованные ферменты, белки, клетки и другие биологически активные материалы Основные преимущества микрокапсулирования следующие: § микрокапсула исключает контакт фермента с биологическими жидкостями; § в микрокапсулу могут быть включены относительно высокие концентрации фермента, достижение которых в кровотоке при использовании фермента в нативном виде невозможно; § в микрокапсулу могут включаться различные ферменты одновременно; § фермент в микрокапсулах может быть дополнительно стабилизирован внутри- или межмолекулярным сшиванием или модификацией растворимыми полимерами.
Биомедицинское применение искусственных препаратов, содержащих иммобилизованные ферменты, белки, клетки и другие биологически активные материалы Вторым по старшинству методом создания искусственных клеток является включение ферментов в липосомы – искусственные фосфолипидные микропузырьки. Ферменты, включенные в липосомы, также предохранены от инактивирующего воздействия внешней среды, а сами липосомы, состоящие из природных соединений, полностью утилизуются в организме. В отличие от микрокапсул, однако, липосомы обладают уникальной способностью доставлять включений в них препарат внутрь клеток, с которыми они взаимодействуют по механизму слияния или эндоцитоза.
Биомедицинское применение искусственных препаратов, содержащих иммобилизованные ферменты, белки, клетки и другие биологически активные материалы Еще одна большая область применения ферментов в медицине, которая открылась только в результате разработки методов их иммобилизации, – это использование иммобилизованных ферментов в различных экстракорпоральных аппаратах для перфузионной очистки различных биологических жидкостей. Частным случаем этого общего подхода является создание ферментных реакторов, которые могут использовать как тромбобезопасные протезы кровеносных сосудов.
Биомедицинское применение искусственных препаратов, содержащих иммобилизованные ферменты, белки, клетки и другие биологически активные материалы Основными преимуществами реакторов на основе иммобилизованных ферментов являются следующие: § возможность избежать непосредственного контакта организма с чужеродным белком и таким образом уменьшить нежелательные реакции на этот белок; § возможность многократного использования реактора; § возможность проведения долговременного лечения. К недостаткам таких реакторов следует отнести не до конца решенные проблемы тромбообразования или сорбции белков крови на чужеродных поверхностях.
Скачать презентацию Иммобилизованные клетки и ферменты их использование в различных
Иммобилизация.ppt