III Kuliah ke-IV Kuliah ke IV V

III Kuliah ke-IV Kuliah ke IV & V m. k. DASAR REKAYASA BIOPROSES TIN 221 METABOLISME II (KATABOLISME & ANABOLISME) DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2012

KONTROL PROSES METABOLISME Penting dipahami untuk melakukan optimasi pengembangan industri bioproses Fluks Metabolisme Laju perpindahan senyawa antara (intermediate) sepanjang lintasan metabolisme. Laju bervariasi tergantung aktivitas enzim, sehingga identifikasi enzim kunci yang mengontrol laju aliran karbon dll untuk sintesis berbagai produk sangat penting dlm. meningkatkan produktivitas Pemahaman tentang bagaimana pengaturan sintesis/ aktivitas enzim sangat penting dalam rekayasa bioproses

Cara Pengontrolan Metabolisme : 1. Pengaturan Pengambilan Nutrien - Kontrol metabolisme diawali dengan pengaturan pengambilan (up-take) nutrien dari lingkungan sekeliling oleh sel transportasi melewati membran sitoplasma Kebanyakan nutrien diambil dengan mekanisme transpor spesifik yang terkontrol, kecuali oksigen dan sedikit senyawa C lain, sehingga setelah jumlah nutrien mencukupi, proses pengambilan nutrien berhenti. - Laju pengambilan (konsumsi) sumber karbon (glukosa) dapat menjadi proses pembatas untuk pertumbuhan sel perlu diperhatikan saat akan meningkatkan produktivitas bioproses !

Substrate-limited growth of microorganisms (sbli. ls. manchester. ac. uk) Kultur Curah (Batch)

Molekul senyawa masuk sel melalui membran sitoplasma dengan cara : 1). Mekanisme Tak Tergantung Energi a). Difusi Pasif b). Difusi terfasilitas 2). Mekanisme Tergantung Energi a). Transpor Aktif b). Translokasi Grup Baca materi kuliah terkait

2. Kompartemenisasi Lintasan Metabolisme - Bentuk sederhana kontrol metabolisme adalah penggunaan kompartemen (organel) di dalam sel, sehingga akumulasi metabolit tertentu terpisah organel digunakan untuk mengontrol reaksi di dalam sel Contoh : Ø Siklus Krebs yang terjadi pada mitokondria eukariota yang terpisah dari glikolisis (dalam sitoplasma) Ø Lokasi biosintesis asam lemak eukariota (dalam sitoplasma) terpisah dari lokasi degradasinya (organel peroxisome) - Bakteri (prokariot) tidak mepunyai kompartemenisasi, sehingga menggunakan cara lain untuk pengontrolan metabolismenya e. g RTE (rantai transpor elektron) pada membran sitoplasma

Eukariot menggunakan organel untuk mengkompartemenisasi lintasan metabolisme, sehingga lintasan metabolisme terjadi pada lokasi spesifik, yaitu : Mitochondria – Siklus Krebs, RTE/Fosforilasi Oksidatif, “The Power house of the Cell”, katabolisme asam amino. Sitosol/ – Glikolisis, Lintasan Pentosa Fosfat, Sitoplasma biosintesis asam lemak, glukoneogenesis. Nukleus – replikasi DNA, transkripsi, produksi RNA Lisosom – Digesti enzimatik senyawa dalam sel (protein, lemak dll)

Apparatus Golgi – modifikasi “Post translational” (modifikasi kimia) membran dan protein, pembentukan membran plasma dan alat pengeluaran. Rough Endoplasmic Reticulum (di lapisan ribosom) – Sintesis “membrane-bound and secretory proteins”. Smooth Endoplasmic Reticulum – biosintesis lipida dan steroid. Peroxisome – reaksi oksidatif melibatkan enzim oksidase dan katalase (yang mengubah peroksida menjadi O 2 dan H 2 O) dan penting pada metabolism/degradasie lemak (cari gambar Apparatus Golgi) , (Source : Lecture 5: Cells: Structure & Function)

3. Kontrol Sintesis Enzim - Enzim di dalam sel terdapat secara : konstitutif (ada pada setiap saat) dan yang lain ada bila diperlukan (induksi) atau bila tidak dibutuhkan lagi akan hilang (represi) - Induksi dan represi diatur oleh gen yang mengkode sintesis protein : transkripsi DNA m. RNA translasi sintesis protein Represi Katabolit Penurunan relatif laju sintesis suatu enzim spesifik, karena ada sumber karbon yang lebih dapat diasimilasi (glukosa) = Efek Glukosa

Contoh : Bila mikroba menjumpai dua sumber karbon (glukosa dan laktosa), maka yang akan dikonsumsi lebih dulu adalah sumber karbon yang paling disukai (glukosa), baru setelah itu mengkonsumsi sumber karbon lainnya (laktosa). Glukosa menekan sintesisi enzim laktase terjadi pertumbuhan sekuensial = “Pertumbuhan Diauksik” Selain sumber karbon, sumber nitrogen, fosfat dan sulfur dapat menyebabkan represi katabolit Keuntungan : sel dapat menggunakan substrat yang paling berguna untuk memproduksi energi dan menghasilkan metabolit

4. Modifikasi Aktifitas Enzim Aktifitas enzim yang telah disintesis dapat diatur dengan berbagai cara : a. Modifikasi “Post-Transcriptional” (modifikasi kimia) Enzim yang telah disintesis dimodifikasi menjadi aktif atau inaktif dengan mengkonversi melalui fosforilasi molekul enzim b. Pengaruh Efektor (Penghambatan Umpan Balik) A B C C D E -- Konsentrasi produk akhir yang tinggi dapat menyebabkan represi sintesis enzim pada lintasan metabolisme respon cepat thd akumulasi produk akhir yang tinggi yang dapat menyebabkan metabolisme terganggu

KATABOLISME Pada mikroba dikenal 4 jalur pemecahan glukosa menjadi asam piruvat 1. Jalur Embden-Meyerhof Parnas (EMP) atau Glikolisis eukariota (fungi) & prokariota (kebanyakan bakteri) 2. Jalur Heksosamonofosfat (HMF) = Pentosa Fosfat = Fosfoglukonat bakteri, berbagai organisme 3. Jalur Entner-Doudoroff (ED) beberapa bakteri, contoh : Zymomonas mobilis penghasil etanol; bakteri asam laktat (homolaktat) 4. Jalur Fosfoketolase (FK) bakteri asam laktat heterolaktat

1. Jalur Embden-Meyerhof Parnas (EMP) atau Glikolisis • Merupakan tahap awal respirasi selular • 2 tahap : 1). tahap persiapan (memerlukan energi)/ATP & 2). tahap menghasilkan energi/ATP • Proses ini tidak tergantung oleh adanya oksigen (lihat lintasan) • Setelah glikolisis selesai, dihasilkan : Ada oksigen respirasi aerob (Siklus Krebs & As. Piruvat Rantai Transpor Elektron) Tak ada oksigen respirasi anaerob /fermentasi Substrat : - Glukosa : masuk ke sel difosforilasi (glukosa-6 -fosfat) - Fruktosa : fruktosa + ATP fruktosa-6 -fosfat + ADP - Galaktosa : galaktosa + ATP galaktosa-1 -fosfat + ADP galaktosa-1 -fosfat + UDP-glukosa glukosa-1 -fosfat + UDP-galaktosa glukosa-6 -fosfat

Jalur Embden-Meyerhof Parnas (EMP) atau Glikolisis Heksokinase Glu-6 fosfat isomerase Terjadi dlm sitoplasma & tidak butuh O 2 Net : 2 ATP Fosfofrukto kinase (PEP)

Jalur Embden-Meyerhof Parnas (EMP) atau Glikolisis Merupakan reaksi konsekutif : 1. Fosforilasi I glukosa oleh ATP; isomerisasi dan Fosforilasi II membentuk fruktosa-1, 6 difosfat dan 2 ADP 2. Pemecahan fruktosa-1, 6 difosfat membentuk 2 mol triosafosfat 3. Oksidasi 3 -fosfo-gliseraldehida dg reduksi NADH 2 dan pengambilan fosfat anorganik (Pi ) pembentukan ikatan berenergi tinggi pd 1, 3 -difosfo-gliserat 4. Pemindahan P dari 1, 3 -difosfo-gliserat ke ADP ATP 5. Isomerisasi 3 -fosfo-gliserat, diikuti dg dehidrasi membentuk P pd fosfo-enol-piruvat 6. Pemindahan P pd fosfo-enol-piruvat (PEP) ke ADP dan membentuk piruvat dan ATP Diperlukan 2 ATP hasil 4 ATP (net 2 ATP) & 2 NADH 2 Piruvat menjadi senyawa awal dalam proses sintesis selanjutnya Contoh : asam laktat, etanol dll.

Pemanfaatan Produk Lintasan EMP : Produk Akhir - Piruvat : diproses lebih lanjut (tergantung ada/tidak O 2) - NADH 2 : “electron carrier”, dioksidasi lebih lanjut pada respirasi atau fermentasi Produk Antara prekursor untuk biosintesis - glukosa-6 -fosfat : prekursor polisakarida, pentosa fosfat dan asam amino aromatik (fenilalanin, tirosin, triptofan) - Fruktosa-6 -fosfat : prekursor glikoprotein - Dihidroksi aseton fosfat : prekursor fosfolipida - 3 -fosfo gliserat : prekursor asam amino (glisin, serin, sistein) - PEP : prekursor asam amino aromatik dan lisin

Aplikasi Metabolit Lintasan EMP - Eukariota (khamir, kapang) Pembuatan minuman beralkohol, roti dan keju Khamir Saccharomyces cerevisiae etanol + CO 2. Pangan & minuman, bahan bakar & pelarut industri (etanol, isopropanol , aseton dll) Diagnostic microbiologists contoh : test kemampuan mikroba (contoh khamir) untuk memfermentasi gula dalam identifikasi s. d tingkat genus - Bakteri : * Produksi asam laktat (bakteri homolaktat) * Produksi asam lemak, alkohol & gas

Contoh FERMENTASI Sumber : 210. 36. 18. 48/gxujing pin/dwwswx/ppt/6. ppt

(Sumber © Kenneth Todar, Ph. D : Online Textbook of Bacteriology)

Bakteri Asam laktat Homolactic (Lintasan EMP) Bila banyak glukosa & oksigen terbatas : 1 mol glukosa pada lintasan EMP 2 mol piruvat 2 mol lactic acid + 2 mol ATP Genus Homolactic LAB : Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus etc. yogurt, buttermilk, sour cream, cottage cheese, cheddar cheese, dan kebanyakan “fermented dairy products”.

2. Jalur Heksosamonofosfat (HMF) = Pentosa Fosfat = Fosfoglukonat Glikolisis

Peranan Lintasan HMF / Pentosa Fosfat • Memproduksi NADPH 2 “electron carrier”, digunakan pada biosintesis asam lemak, steroid dan deoksiribonukleotida • Sumber gula pentosa (ribosa) unt sintesis nukleotida dan asam nukleat • Sumber eritrosa-4 -fosfat, suatu prekursor asam amino dan senyawa fenolik (lignin, tanin, antosianin) • Tidak menghasilkan energi secara langsung, tetapi NADPH 2 yang terbentuk jika masuk ke dalam Rantai Transpor Elektron terbentuk ATP Lintasan dpt digunakan untuk substrat gula pentosa yg banyak terkandung pd pakan ternak (hemiselulosa, xylan, pektin, asam nukleat)

Kaitan Glikolisis dgn Jalur Heksosamonofosfat (HMF / Pentosa Fosfat )

Heterofermentative LAB : Lintasan Pentosa Fosfat - Mempunyai enzim fosfoketolase : mengubah pentosa fosfat (xylulose- 5 -fosfat) gliseraldehid-3 -fosfat + asetil fosfat - Glukosa glukosa-6 -fosfat 6 -fosfoglukonat Xylulose-5 -fosfat gliseraldehid fosfat + asetil fosfat *Gliseraldehid fosfat asam laktat *Asetil fosfat etanol dan asam asetat Contoh bakteri : Leuconostoc, Oenococcus, Weissella Pembuatan : kefir, sauerkraut

Metabolisme Glukosa oleh Heterolactic Lactobacilli Lintasan Pentosa Fosfat Glucose -------> Lactic acid + ethanol + CO 2 + 1 ATP (net).

3. Jalur Entner-Doudoroff (ED) Mikroba tak punya enzim fosfofruktokinase (KDPG)

Jalur Entner-Doudoroff (ED) Tahapan reaksi : * Aktivasi glukosa oleh ATP * Oksidasi gugus aldehid pada glukosa-6 -fosfat membentuk 6 -fosfo-glukonat dan reduksi NADPH 2 * Dehidrasi 6 -fosfo-glukonat membentuk 2 -keto-3 -deoksi-6 -fosfo glukonat (KDPG) * Pemutusan KDPG menghasilkan piruvat dan gliseraldehida 3 -fosfat melewati jalur Glikolisis menghasilkan : 2 mol ATP (net 1 ATP) dan 1 mol NADPH 2

Mikroba yang Menggunakan Lintasan ED : -Tidak memiliki enzim phosphofructokinase-1. -Kebanyakan mikroba bersifat aerobik, karena ATP yang dihasilkan per mol glukosa rendah - Contoh : Pseudomonas aeruginosa, bakteri Gram (-) Azotobacter, bakteri Gram (-) penyubur tanah (N 2 udara) Rhizobium, bakteri Gram (-) penyubur tanah Zymomonas mobilis, bakteri Gram (-) facultative anaerob etanol, "cactus beer" ( "pulque“), & tequila (Meksiko) Xanthomonas Campestris, bakteri Gram (-) gum xanthan

Siklus Asam Sitrat (TCA Cycle = Siklus Krebs)) - Bila tersedia oksigen, banyak mikroba dapat mengoksidasi piruvat melalui Siklus Krebs oksidasi sempurna substrat menghasilkan CO 2. (Melepaskan lebih banyak energi dibandingkan glikolisis) - Siklus berperan penting dalam memberikan senyawa awal (intermediat/prekursor) untuk biosintesis : - asam amino, - asam lemak - glukosa (dgn glukoneogenesis) - energi

Siklus Asam Sitrat (TCA Cycle = Siklus Krebs)

ANABOLISME (BIOSINTESIS) 1. Biosintesis Asam Amino & Protein 2. Biosintesis Asam Lemak 3. Biosintesis Karbohidrat 4. Biosintesis Nukleotida 5. Biosintesis Antibiotika 6. dll

The main pathways of biosynthesis in procaryotic cells

Biosintesis Asam Amino - Prinsipnya reaksi transaminasi, yaitu pengikatan gugus amonia (NH 3) pada gugus karboksilat senyawa α-ketoglutarat (dari Siklus Krebs) - Lintasan biosintesis asam amino dimulai dari masuknya nitrogen dari gugus NH 3 melalui sintesis glutamat, selanjutnya nitrogen dipindahkan ke asam amino lain dengan reaksi transaminasi. - Pengikatan gugus amin : a. Secara langsung, contohnya sintesis glutamat dengan menggunakan α-ketoglutarat b. Secara tidak langsung, mula-mula gugus NH 3 diikat oleh glutamat, pengikatan gugus NH 3 selanjutnya oleh glutamat akan menghasilkan glutamin dari glutamin gugus amino dipindahkan ke α-ketoglutarat menghasilkan glutamat

Glutamat dan glutamin merupakan senyawa utama yang mengasimilasi nitrogen untuk diberikan pada lintasan sentral biosintesis asam amino. Selanjutnya gugus amino dari glutamat dan glutamin dapat dipindahkan ke senyawa lain dengan beragam reaksi transaminasi.

Biosintesis Asam Amino

Synthesis of the various amino acids in a family frequently requires many separate enzymatically catalyzed steps starting from the parent amino acid Sumber : 210. 36. 18. 48/gxujingpin/dwwswx/ppt/6. ppt

Biosintesis Protein - Asam amino harus diberi energi sebelum bergabung menjadi protein - Pemberian energi oleh ATP Asam amino + ATP asam amino-AMP + pirofosfat (2 P) - Protein memiliki sekuens asam amino tertentu “blue print” untuk membuat protein terkandung pada sekuens nukleotida DNA sel mikroba.

Biosintesis Asam Lemak & Lipida • Biosintesis lemak dimulai dari biosintesis asam lemak • Prekursor : Asetil Ko-A • Pemanjangan rantai karbon (C) asam lemak menggunakan Malonil Ko. A (C 2) • Biosintesis asam lemak rantai panjang memerlukan acyl carrier protein (ACP) sbg “jangkar”

Reaksi pada biosintesis asam lemak : 1. Pemindahan gugus asetil dan gugus malonil dari Co. A ke ACP : asetil/malonil-Co. A asetil-ACP & malonil-ACP 2. Kondensasi asetil-ACP + malonil-ACP membentuk asetoasetil-ACP dengan melepaskan CO 2. 3. Reaksi reduksi, reaksi dehidrasi dan reaksi reduksi menghasilkan butyryl-ACP asam butirat - Urutan reaksi-reaksi ini merupakan siklus lintasan pembentukan dan penambahan panjang rantai asam lemak hasil sintesa dari urutan reaksi ini adalah molekul asam lemak yang terikat dengan ACP. Penghilangan ACP dengam enzim menghasilkan asam lemak tertentu

Contoh : Butiril ACP Bila ACP dilepaskan oleh enzim asilase hidrolitik akan dihasilkan asam butirat (C 4) Butiril-ACP + malonil-ACP Asam lemak C 6 - ACP + CO 2 Asam lemak C 6 Asam Lemak : C 4 : asam butirat C 6 : asam kaproat Asam lemak C 8 : asam kaprilat C 10 : asam kaprat C 12 : asam laurat dst C 14 : asam miristat C 16 : asam palmitat C 18 : asam stearat

Biosintesis Asam Lemak (ACP) CO 2 (ACP)

The biosynthesis of fatty acids Shown is the biosynthesis of the C 16 fatty acid, palmitate. The condensation of acetyl-ACP and malonyl. ACP forms acetoacetyl. Co. A. Each successive addition of an acetyl unit comes from malonyl-Co. A. Sumber : 210. 36. 18. 48/gxujingpin/dwwswx/ppt/6. ppt

Biosintesis Asam Lemak

Biosintesis Karbohidrat • Mikroba autotrof mensintesis KH dari CO 2 (fiksasi CO 2 dari udara) dgn sekuens reaksi : CO 2 (atmosfir) Triosa (monosakarida C 3) Pentosa (C 5) & Heksosa (C 6) Nukleotida Polisakarida (mengandung (peptidoglikan dinding sel, selulosa, ribosa & deoksiribosa) pati dll) RNA & DNA • Mikroba heterotrof menggunakan senyawa organik Senyawa C 5 (pentosa) atau C 6 (heksosa) sbg sumber C Contoh : E coli : glukosa + ATP + 2 NADP ribosa-5 -fosfat + CO 2 + ADP + 2 NADPH 2 unt. sintesis nukleotida

Biosintesis Karbohidrat • Lintasa Glikolisis & Pentosa Fosfat (HMF) digunakan untuk interkonversi senyawa gula • Monosakarida agar bisa bergabung menjadi polisakarida harus diberi energi (dari ATP), contohnya : * UDP-glukosa (uridin difosfat-glukosa) Glukosa + ATP + UTP UDP-glukosa + ADP + pirofosfat polisakarida Tidak semua monosakarida yang diberi energi untuk mensintesis gula UDP, contoh : * Fosforibosa pirofosfat Ribosa fosfat + ATP fosforibosa pirofosfat + AMP purin & pirimidin

Biosintesis Nukleotida (RNA & DNA) Nukleotida Purin Ribosa fosfat (dari Jalur HMF/Pentosa Fosfat ) ATP Fosforibosa pirofosfat Glisin, glutamin, asam aspartat, ATP Inosin monofosfat (IMP) Asam aspartat, GTP ATP, glutamin Adenosin monofosfat (AMP) Guanosin monofosfat (GMP) (untuk sintesis RNA) (untuk sintesis RNA) Deoksiadenosin monofosfat (d. AMP) Deoksiguanosin monofosfat (d. GMP) (untuk sintesis DNA) (untuk sintesis DNA)