И Х Б Ф М Ферменты репарации ДНК

И Х Б Ф М Ферменты репарации ДНК как мишени для создания новых лекарственных препаратов Лаврик О. И. Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Кафедра физико-химической биологии и биотехнологии Алт. ГУ

ДНК – хранилище генетической информации

Генотоксические факторы окружающей среды Космическое излучение УФ-излучение Естественные и искусственные химические препараты Озон и другие реакционноспособные газы Инфекции и другие физиологичекие условия, являющиеся причиной оксидативного стресса Источники подземного радона Число повреждений ДНК составляет около миллиона на клетку в сутки

«ТРАНС-СИБИРСКАЯ» ДНК Число повреждений ДНК, ежедневно возникающих в каждой клетке человека, можно соотнести с возникновением аварий на Транссибирской магистрали через каждые 100 метров пути.

Механизмы повреждений и репарации ДНК спонтанные реакции алкилирующие эндогенные окислители агенты активные формы кислорода O 6 -me. G УФ-излучение мутагены окружающей среды рентгеновское излучение ошибки репликации апуриновые/апиримидиновые (АР-) сайты окисленные дезаминированные и алкилированные основания однонитевые разрывы пиримидиновые димеры крупные аддукты двойные разрывы неправильное спаривание оснований вставки, делеции репарация оснований репарация нуклеотидов репарация двойных разрывов ДНК репарация неправильно спаренных оснований прямая репарация

Клеточный ответ на повреждения ДНК

ая тн ен рма м иг оде ма, П ер но а) кс ела ном (м рци ка Синдром Коккейна Рак Пр це огре ре сс и б па рал вны ра ьны й ли ч й Дефекты систем репарации ДНК Тр и ди хоти стр о оф ия Умственная и иммунная недостаточность р а ат К Старение а т ак

Болезни человека, ассоциированные с ДНКгликозилазами Белок Заболевание UNG Гипериммуноглобулинемия М TDG Рак толстого кишечника SMUG 1 Рак толстого кишечника MBD 4 Рак поджелудочной железы, желудочнокишечного тракта, матки MPG Рак легких Рак толстого кишечника NTHL 1 Нет данных NEIL 1 Рак желудка и толстого кишечника NEIL 2 Рак толстого кишечника NEIL 3 Нет данных OGG 1 Рак легких, желудочно-кишечного тракта, простаты Рак почки Врожденный семейный аденоматозный полипоз Рак желудка MUTYH Доказанная генетическая связь Эпидемиологическая ассоциация Утрата гетерозиготности в опухолевой ткани

Системы репарации являются мишенями для создания новых лекарств Действие используемых в клинике химиотерапевтических препаратов и экзогенных факторов (ионизирующая радиация) основано на повреждении ДНК и модулируется системами репарации. Поэтому избирательное ингибирование репарации улучшает терапевтические эффекты.

Эксцизионная репарация оснований Ионизирующее излучение (одцепочечные разрывы Окисление, метилирование и дезаминирование оснований ДНКгликозилазы PARP 1 Спонтанный гидролиз Х XRCC 1 PNK APE 1 XRCC 1 Pol +d. GTP PCNA Pol /ε +4 d. NTP FEN 1 ДНКлигаза III +ATP ДНКлигаза I +ATP

Окисленные, алкилированные и дезаминированные основания АР-сайты возникают в ДНК млекопитающих с частотой 10, 000 -50, 000 на клетку в день DNA glycosylase Спонтанный гидролиз N-гликозидной связи Х AP-сайты цитотоксичны и мутагенны APE 1 XRCC 1 Pol +d. GTP DNA ligase III +ATP

Образование APсайтов в нуклеосоме приводит к возникновению ДНКбелковых сшивок или двухцепочечных разрывов ДНК (Sczepanski et al, 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 22475– 80).

Типы ДНК, содержащих АР-сайты, использованные для модификации белков экстрактов Синтез кольцевой АР-ДНК Линейная AP-ДНК Кольцевая AP-ДНК

Идентификация PARP 1 как белка, взаимодействующего с АР-сайтами (MALDI-TOF-MS-анализ) бе белок к бело + Bio Ковалентная сшивка AP-ДНК, содержащая Белки клеточного радиоактивную экстракта метку и остаток биотина Стрептавидиновые «шарики» Адсорбция белок Промывка Ковалентный аддукт ДНК-белок Эл PARP 1 был идентифицирован как наиболее достоверный кандидат. Probability score 248; Sequence coverage 38%. MALDI-TOF-MS Поиск белка в базах данных Bio Раз юция де в П ление АА Г зв ли но си ле п е ри г Т укт адд ный к ент -бело ал Ков ДНК Радиоавтография белок Окрашивание лок Bio Khodyreva et al, Lavrik, PNAS, 2010

Поли(ADP-рибозил)ирование, катализируемое PARP 1 Rouleau M. et al, 2004

Взаимодействие PARP 1 с белками репарации ДНК Lig 3 Pol b PARP 2 XRCC 1 APE 1 OGG 1 FEN 1 APTX TDG PCNA MUTYH BRAC 1 PALF BRAC 2 TP 53 XRCC 2 WRN PARP 1 XRCC 3 NBS 1 XRCC 4 PARG XRCC 5 Poli XRCC 6 TOPO 1 XRCC 7 MRE-11 A DNTT RAD 51 ERCC 2 ERCC 5 = Белки, вовлеченные в эксцизионную репарацию оснований

Эксцизионная репарация оснований Ионизирующее излучение (одцепочечные разрывы Окисление, метилирование и дезаминирование оснований ДНКгликозилазы PARP 1 Спонтанный гидролиз Х XRCC 1 PNK APE 1 XRCC 1 Pol +d. GTP PCNA Pol /ε +4 d. NTP FEN 1 ДНКлигаза III +ATP ДНКлигаза I +ATP

APE 1 Белки, взаимодействующие с центральным интермедиатом эксцизионной репарации оснований у высших эукариот Белки «check-point» дрожжей, узнающие подобные повреждения в ДНК Sukhanova et al, DNA Repair, 2011, 2014 Lavrik et al, J Biol Chem, 2001 Cistulli et al, DNA Repair, 2004 PARP 1 Pol FEN 1 Pol ε PCNAподобная структура

Эксцизионная репарация нуклеотидов Gillet and Schärer, Chem Rev, 2006, 106, 256 -276

PARP 1 - участник и регулятор процесса нуклеотидной репарации Взаимодействие c полимером ADP-рибозы и (ADP-рибозил)ирование ключевых факторов нуклеотидной репарации, катализируемое PARP 1, может играть важную роль в регуляции этого процесса и объяснять влияние на него PARP 1 на уровне хроматина.

Эксцизионная репарация нуклеотидов Gillet and Schärer, Chem Rev, 2006, 106, 256 -276

Поли(АДФ-рибозо)полимераза 1 (PARP 1) Активация PARP 1 Гипер актив Повреждение ДНК ая нн я Регуляция ре ме ваци У и воспалительного кт а ответа Репарация ДНК Истощение запасов NAD+ Восстановление клетки, в том числе раковой Некроз Опухоль ация

Роль PARP 1 в развитии ряда заболеваний Повреждения ДНК Ингибирование PARP 1 Умеренная активация Активация PARP 1 Регуляция воспалительного ответа Репарация ДНК Гиперактивация Истощение запасов NAD+ Некроз, воспаление Восстановление клетки, в том числе раковой Онкологические заболевания Сенсибилизация опухоли к терапии Сокращение области поражения, подавление воспаления Диабет Инсульт, инфаркт Воспалительные заболевания Нейро-дегенеративные заболевания

Комплекс каталитического домена PARP 1 с ингибитором одноцепочечный разрыв PARP 1 XRCC 1 Iwashita et al. , 2005, FEBS Letters, 579, p. 1389

ПОИСК И СОЗДАНИЕ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ МИШЕНИ PARP 1 Усиление действия противоопухолевых агентов PARP 1 Гибель опухолевых клеток ь уровен низкий ия ДНК ден повреж PARP 1 Протективное действие высокий уровень повреждения ДНК PARP 1 расщепление PARP 1 каспазой-3 Ферменты репарации ДНК истощение клеточных запасов NAD+ и ATP PARP 1 Репарация ДНК производные глицерретовой кислоты приводят к апоптозу клеток по каспазо– зависимому пути пиперазиновые производные бетулоновой кислоты -мягкие ингибиторы PARP 1, ДНК-полимеразы β и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1. Эти соединения также проявляют высокий антиметастатический эффект производные усниновой кислоты инактивация PARP 1 мягкие селективные ингибиторы PARP 1 деградация ДНК Апоптоз Некроз Диабет Инсульт Ишемия и инфаркт Черепно-мозговые травмы Воспалительные заболевания Нейро-дегенеративные заболевания

Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (АРЕ 1) вн сти о ти ак е Гип ерэ и ен л в а од П ксп рес с ия Защита от апоптоза Нормальная активность Апоптоз Опухоль Процессинг АП-сайтов, репарация ДНК

Тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 процессирует аддукты Топоизомеразы1 с ДНК и 3'-концевые группы Dexheimer T. S. et al. (2008) Anticancer Agents Med Chem. 8, 381 -389

Mutation of TDP 1 causes cerebellar degeneration and peripheral neuropathy typified by patients with SCAN 1 The cerebellum is a common target for disorders with DNA repair defects H 493 R mutation in Tdp 1 is responsible for the inherited disorder, spinocerebellar ataxia with axonal neuropathy (SCAN 1)

Роль Tdp 1 в развитии заболеваний 1 я М ци та у N CA S Тирозил-ДНКфосфодиэстераза Спиноцеребеллярная атаксия 1 (Tdp 1) Уст ран ком ение пле к кса овал Top ентн о 1 и ДН го К Действие, обратное ингибиторам Тор1 , таким как камптотецин

Ku 70/80 в комплексе с ДНК Angew. Chem. Int. Ed. , 2003, 42, 2946 – 2974

Функции Ku-антигена Ku-антиген – многофункциональный белок, участвующий в: üРепарации двухцепочных разрывов ДНК üОбеспечении вариабельности иммуноглобулинов üРегуляции репликации ДНК üРегуляции транскрипции üПоддержании целостности теломерных концов üРегуляции апоптоза üАдгезии клеток (участие в метастазировании) üПроникновении в клетку и встраивание в геном человека ретровирусов Ku-антиген (в зависимости от его содержания в клетках) может проявлять как проонкогенные, так и антионкогенные свойства

Определение Ku-антигена в клетках меланомных линий Использование АР-ДНК позволяет оценивать количество Kuантигена в экстрактах клеток… …и обнаруживать укороченную с Сконца форму Ku 80 Укороченная с С-конца форма Ku 80 в виде димера с Ku 70 связывается с ДНК, но неактивна в репарации двухцепочечных разрывов ДНК, что повышает чувствительность клеток к действию ионизирующего излучения. Ilina et al, Mutat Res, 2010

Взаимодействие регуляторных белков репарации ДНК с интактными и гидролизованными АР-сайтами, опосредованное образованием основания Шиффа АP-сайт вблизи двухцепочечного разрыва АР-сайт Гидролизованный напротив бреши АР-сайт Все идентифицированные белки ответственны за чувствительность клеток к ионизирующему излучению. АР-ДНК специфической структуры могут использоваться для мониторинга уровня этих белков в клеточных экстрактах. Khodyreva et al, Lavrik, PNAS, 2010; Ilina et al, BBA, 2008; Prasad et al, Mol Cell, 2007; Nazarkina et al, DNA Repair, 2007

Реакционноспособные ДНК-зонды в сочетании с масс-спектрометрией являются перспективным инструментом для выявления и идентификации белковых факторов репарации и репликации ДНК, а также для мониторинга систем репарации ДНК в экстрактах клеток и ядер.

И Х Б Ф M Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Ходырева С. Н. , Речкунова Н. И. , Ильина Е. С. , Суханова М. В. , Мальцева Е. А. , Красикова Ю. С. , Кутузов М. М. , Захаренко А. Л. Prasad R. , Wilson S. H. Research Triangle Park, NC, USA CNRS, UPR 4301, Centre de Biophysique Moléculaire, Orléans Cedex, France D’Herin C. , Boiteux S. FRE 3211, IREBS, CNRS, Université de Strasbourg, ESBS, France Amé J. -C. , Schreiber V. Biosignal Research Center, Kobe University Japan Sugasawa K.

Кафедра физико-химической биологии и биотехнологии Создана первая межфакультетская кафедра Алтайского университета при участии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Алтайский государственный университет Зав. каф. член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Ольга Ивановна Лаврик Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Зам. зав. каф. кандидат биологических наук, зам. директора Южно. Сибирского ботанического сада Сергей Владимирович Смирнов Кафедра организована 25 Октября 2013 г. На данный момент штат кафедры составляет 5 человек. ü ü ü Приоритетными направлениями деятельности кафедры являются: подготовка квалифицированных специалистов с высоким уровнем теоретических и практических знаний в области биотехнологии, молекулярной биологии и биомедицине; создание инфраструктуры развития биотехнологии в Барнауле; формирование и реализация приоритетных инновационных и инвестиционных проектов биотехнологии