И на все это надо как то реагировать

И на все это надо как то реагировать. . . 1. Ответ на уровне генома (ок. 10 -15 мин. ) 2. Ответ на уровне мембран (ок. 1 -2 мин)

Внутриклеточные рецепторы сигнала Репрессор Aux/IAA формирует гетеродимер с ARF, что блокирует экспрессию ауксин-зависимых генов. После снятия репрессии гомодимеры или мономеры ARF обеспечива ют трансляцию ИУКрегулируем ых генов. Белок Fбокса TIR 1 метит ауксиновый репрессор Aux/IAA для убиквитинирова ния и последующего протеолиза.

Внутриклеточные рецепторы сигнала

Транскрипционные факторы У арабидопсис в регуляции транскрипции участвует до 15% белков. Одни из них обеспечивает доступность хроматина для транскрипции (например, ацетилаза и деацетилаза гистонов), другие белки (факторы транскрипции) , специфически связываются с цис-элементами соответствующих генов, , вызывают активацию (или подавление) работы РНКполимеразного комплекса и экспрессию соответствующих генов. третьи – являются кофакторами и влияют на транскрипцию путем белок-белковых взаимодействий с соответствующими факторами транскрипции. Транскрипционный фактор (ТФ) – это белок, который после перемещения в ядро клетки регулирует транскрипцию, специфически взаимодействуя с ДНК либо с другим белком, который может образовывать комплекс белок-ДНК. Один и тот же регуляторный белок на разных этапах развития способен взаимодействовать с различными генами. Именно ТФ отвечают за селективность и специфичность генной регуляции в различных клетках и тканях растительного организма. У арабидопсиса имеется более 1600 ТФ, содержащих специфические ДНКсвязывающие домены и способных активировать или подавлять транскрипцию. Количество транскриптов, формирование которых контролируется ТФ в арабидопсис более 28000 !!! В процессе клеточной дифференцировки именно появление нового ТФ является сигналом для активации (или подавления) транскрипции генов на определенной стадии морфогенеза и появления необходимых генных продуктов.

Факторы транскрипции У арабидопсиса выявлено более 40 типов факторов транскрипции, которые обычно классифицируют по строению ДНКсвязывающих доменов.

Транскрипционные факторы Гомеодомен-содержащие белки. У арабидопсиса выявлено около 90 белков этого типа. MADS-белки. Это суперсемейство транскрипционных факторов включает более 100 белков. AP 2/ERF (APETALA 2/ethylene response factor) суперсемейство включает около 150 белков. MYB-белки (от myeloblastosis). Это суперсемейство включает около 200 белков. Белки b. HLH (basic helix-loop-helix). В это суперсемейство входит около 140 белков, Белки типа b. ZIP (basic leucine zipper), Выявлено около 80 белков этого типа. NAC-белки. ARF семейство транскрипционных факторов включает более 20 белков. C 2 H 2(Zn)-тип факторов транскрипции насчитывает более сотни белков. GRAS-тип ТФ включает более 30 белков. GARP семейство транскрипционных факторов включает более 50 белков. CCAAT-семейство факторов транскрипции включает более 30 белков. ABI 3/VP 1 -белки и другие….

Пример мишеней для факторов транскрипции: боксы (response elements -RE) в промоторах генов G-бокс или G-ABRE Транскрипционные факторы, которые специфически связываются с АВRE, называют ABF (АВRE Binding Factors). Фактор транскрипции ABF 1 специфически индуцируется АБК и холодом, ABF 2 и ABF 3 синтезируются в ответ на АБК и засоление, появление ABF 4 стимулируется в ответ на АБК,

Системы усиления сигнала с мембранных рецепторов сигнал фосфолипаза D фосфолипаза С аденилат-циклаза ККМАРК ИФ 3 ФК ц. АМФ КМАРК ПК ПК ПК ФРТ ФРТ ФРТ Са 2+ ДАГ м. РНК ответ клетки м. РНК ФРТ ФРТ ПК ФДК, ЖК ПЖК ЛФС СОД ПК СК ПК ПК ЛОГ ФРТ Са 2+ Н 2 О 2 - О- 2 сигнал ПК ПК СК ? ц. АДФриб фосфолипаза А 2 НАДФН-оксидаза сигнал ПК ФРТ ФРТ ц. ГМФ ФЛД МАРК NO NO-синтаза Н+ сигнал ответ клетки

Три группы мембранных рецепторов сигнала

Двухкомпонентные рецепторные системы: гистидинкиназы микроорганизмов и растений (ETR 1) Бактерии Растения

Гетеротримерные G-белки

Вторичные мессенджеры у эукариотических организмов

Аденилат-циклазная (ц-АМФ-ная) сигнальная система

Работа каждой из фосфолипаз может приводить к образованию вторичных мессенджеров

Работа фосфолипазы А 2 проводит к образованию жасмонатов

Работа фосфолипазы D приводит к образованию фосфатидной кислоты – вторичного мессенджера фосфатидной сигальной системы.

Фосфолипаза С обеспечивает работу фосфоинозитольной (кальциевой) сигнальной системы

Компартментация на уровне клетки КС 1 -10 м. М Ядро Мх 1 м. М 10 -50 н. М Хл 1 м. М 100 -200 н. М Вакуоль ЭР 1 -10 м. М

Кальций 0, 5 – 1, 5 % 1. Низкая концентрация в цитозоле 10(7) M. 2. Низкая метаболическая подвижность 3. Безусловная необходимость в экстраклеточном матриксе (на поверхности Пл и в КС) 4. Кальций – вторичный мессенджер.

Транспорт кальция через мембраны 1. Са-АТФазы: 2. Са/Н антипорт 3. Са-каналы

Транспорт кальция в растительной клетке

Са 2+-канал – пример рецепторных ионных каналов

Лигандами для разных Са 2+ каналов могут служить: • инозитол-1, 3, 5 -трифосфат (вакуоль, ЭПР) • ц. АДФ-рибоза (вакуоль, ЭПР) • никотиновая кислота аденин динуклеотид фосфат (ЭПР) • Глутамат (плазмалемма) ц. АДФриб и НКАДФ образуются одним ферментом (АДФрибозилциклазой) из НАД и НАДФ, соответственно

Ca-каналы Furuichi e. a. , 2001

Cтроение потенциалзависимого Са-канала животных (Trewavas, 2000).

Основные системы транспорта Са 2+ в мембранах растительных клеток (Са-АТФазы). Са 2+АТФазы принадлежат к большому кругу АТФаз Р-типа Са 2+АТФазы ПМ ( Km = 0, 4 - 12 мк. М ), стимулируется кальмодулином Са 2+АТФазы ПМ 2 (вакуоль) Са 2+АТФазы ПМ 3 (ЭР) Са 2+АТФазы ЭР

[Ca 2+] 1 2+ -10 м. М Са АТФаза ПМ 3 Са 2+ АТФаза ЭР ЭРVD Ca 2+ кан ЭР [Са 2+] 1 м. М IP 3 -Ca 2+ кан VD-мех Ca 2+ кан VD Ca 2+ кан Макси Кат кан Са 2+ АТФаза ПМ 1 Клеточная стенка Цитозоль [IP 3] [Са 2+] 100 -200 н. М Са 2+ АТФаза ПМ 2 Вакуоль + ВIP 3 -Ca 2+ кан PLC Н+ АТФаза Н+ [Са 2+] 1 -10 н. М Н+ Са 2+/Н+-АП ц. АДФРиб Са 2+ кан PIP + 2 SVD Ca 2+ кан + G-бел 2+]цит [Ca BVD Ca 2+ кан Рец ПМ ПМ Рис. 3. 4. 2. 1. Основные растительных клеток. Стимул системы транспорта Са 2+ в мембранах

Ca-АТРазы

Са 2+/Н+ антипорт Выкачивание Са 2+ из цитозоля с участием Са 2+/Н+ антипорта, сопряжено с вакуолярной Н+ АТФазой, для которой гомеостатирование [Са 2+]цит считается конститутивной функцией.

Са /H-обменники

Са /H-обменник Furuichi e. a. , 2001

Разнообразие путей входа Са 2+ в цитозоль вместе с разнообразием путей выхода (Са 2+ помпы) создают большую гибкость в контроле за потоками Са 2+ как в пространстве, так и во времени и обеспечивают возникновение специфического Са 2+ сигнала, локализованного в определенных участках клетки.

Система мембранного транспорта ионов Са в растительной клетке

Измерение концентрации ионов Са 2+ Iquin-2; II fura-2, indo-1; III - fluo-3, rhod-3; IV - calcium-green, calcium-orange, oregon green-488. (Изготовлены на основе хелаторов - EGTA и BAPTHA, с которыми связана хромофорная группа). Белок акворин, люминисценция которого меняется в зависмости от концентрации ионов Са 2+ (выделен из медузы Aequorea aequorea ). Зонды-“хамелеоны” (являются комбинацией кальмодулина и зеленого флуоресциирующего белка (GFP). Ионоселективные электроды и patch-clamp.

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Метод FRET – изучение динамики Ca 2+ с помощью генно-инженерной конструкции BFP Кальмодулин M 13 Yellow Fluorescent Protein Blue Fluorescent Protein BFP YFP Регистрация результата M 13 Са 2+ YFP Кальмодулин Са 2+ Желтый светофильтр

Кальциевые спайки, осцилляции и волны

Что происходит, когда открываются ионные каналы

Активность ионных каналов может определять: • Величину мембранного потенциала • Осмотический потенциал и тургор • Поступление веществ извне (за счет ко-транспорта) • Направление роста • «Кальциевый ветер»

Длительное сохранение высокой концентрации кальция в цитоплазме может быть летально. Клетки избегают гибели, используя либо низкоамлитудные, либо очень кратковременные кальциевые сигналы в форме отдельных спайков, осцилляций или Са-волн. Для кодирования кальциевого сигнала могут быть использованы его пространственная локализация, продолжительность (частота) и амплитуда. Trewavas & Malho [1999] сравнивают кальциевый ответ на конкретный сигнал с "отпечатком пальцев", “Finger prints” поскольку он обладает уникальной пространственной структурой (signature).

Кальциевые спайки Kiegle et al. , 2000

Кальциевые осцилляции Allen et al. , 2001

Осцилляции кальция при нанесении Nod-фактора на корневой волосок

Кальциевые волны

A. Trewavas, 2000

Растущая пыльцевая трубка VD-мех Са 2+ каналы Подобные каналы могут иметь большое значение в восприятии тургора при удлинении корневого волоска и пыльцевой трубки.

Изменение флуоресценции fluo-3 AM в процессе оплодотворения яйцеклеток Zea mays (Digonnet e. a. , 1997).

Флуо-3 Волна повышения концентрации кальция в протопластах клеток листа пшеницы после индукции красным светом

Замыкающие клетки устьиц

Са 2+ в комплексной сети передачи информации служит универсальным посредником 1. Механический стресс 2. Гиперосмотический стрес 3. Гравитропическая реакция 4. Рост пыльцевой трубки 5. Устьичные движения 6. Растущий корневой волосок 7. Восприятие красного света

У растений обнаружены рецепторо-подобные киназы RLK (Receptor Like Kinase) похожи на рецепторные тирозиновые киназы животных. Отличие состоит в большом разнообразии внеклеточных доменов и в серин/треониновой специфичности.

Разные RLK-гомологи отличаются внеклеточным доменом Белок-белковое узнавание (LRRпоследовательности) Ковалентная сшивка с полимерами клеточной стенки Связывание углеводов (лектины)

Функции ГТФ-аз ROP-семейства, связанных с рецепторными киназами • «восприятие» информации о состоянии внеклеточного матрикса (связывание с интегральными молекулами) • регуляция актинсвязывающих белков • регуляция активности фосфатидилинозитолмонофосфаткиназы (PIP киназа - состав липидного бислоя) • взаимодействие с другими трансдукции сигналов в клетке системами (ROP-retinopathy of prematurity)

ROP и полимеризация цитоскелета активация мембрана ROP Актинорганизующие белки Актин PIPкиназа Другие сигнальные каскады (MAPK)

С организацией цитоскелета связаны: • Компартментация в клетке (органелл, сложных белковых комплексов, отдельных молекул) • Распределение механических напряжений • Пространственная организация метаболических и регуляторных процессов

Кортикальный цитоскелет (актиновые филаменты)

Трансдуксон

Са-связывающие белки

Са-связывающие «белки-буферы» и переносчики

Кальциевые белкисенсоры

Формирование и распространение Са-сигнала 1. Рецепция первичных сигналов и активация Са-каналов. 2. Локальное повышение уровня Са в цитоплазме (кодирование Са-сигнала). 3. Распространение и усиление Са-сигнала за счет Са-каналов эндомембран. 4. Связывание ионов Са с белками-сенсорами и декодирование Са-сигнала. 5. Передача Са-сигнала (протеинкиназами) на исполнительные механизмы. 6. «Тушение» Са-сигнала Са-АТРазами и Са/Н-обменниками. 7. Дефосфорилирование белков и возвращение к исходной ситуации.

Annexins (annexin folds) C 2 -domain containing proteins

Кальмодулин

В геноме A. thaliana только 7 генов кодируют Cа. M, а 50 генов кодируют KML-белки

В зависимости от субстратной специфичности киназы можно разделить на • Серин/треониновые • Тирозиновые • Гистидиновые В биохимии растений классификация киназ основана на их локализации (трансмембранные, нетрансмембранные) и на физиологической функции (например, - киназы отвечающие на кальций)

Среди множества физиологических функций протеинкиназ можно выделить • Кальций-зависимые ПК • Циклин-зависимые ПК • МАРК (митоген-активируемые ПК) • Рецептороподобные ПК

Са-зависимые протеинкиназы

Циклин-зависимые киназы • CDK (cyclin dependent kinase) – играют ключевую роль в регуляции клеточного цикла клетки • Это сер/тре киназы, активность и субклеточная локализация которых определяется циклинами • Регуляция активности комплекса циклин-CDK осуществляется фосф/дефосф киназной субъединицы, а также белками ингибиторами

МАР киназы • MAPК (Mitogen Activated Protein Kinase) участвуют в передачи сигнала от многих физиологических стимулов • Каскад состоит из трех киназ МАРККК>MAPKK>MAPK (>фосфорилирование факторов транскрипции, действие на цитоскелет и т. д. ) • На уровне МАРККК может осуществляться взаимодействие между разными каскадами

МАР киназы передают сигнал от разных физиологических стимулов

Фосфатазы обращают результат действия киназ • Фосфатазы могут действовать повсеместно и неспецифически либо локально и строго специфически • Действие фосфатаз возвращает сигнальную систему в исходное (неактивное) состояние • В некоторых случаях фосфатазы могут «включать» каскад сигнальных событий