http goo gl 9 acqt M Лекция 4

http: //goo. gl/9 acqt. M Лекция 4: • Транскрипция мт. ДНК • Метилирование мт. ДНК 1

Транскрипция мт. ДНК PMID: 22137970 Три транскрипта: 1) C HSP 1 – в D-loop 2) C HSP 2 – upstream 5’-конца 12 S r. RNA (частота инициации в 20 раз ↓) 3) С LSP – в D-loop 2

В транскрипции участвуют: • POLRMT • TFAM (h-mt. TFA – transcription factor A) • TFBM 1 (h-mt. TFB 1) • TFBM 2 (h-mt. TFB 2) - образует гетеродимер с POLRMT • MTERF 1 (mitochondrial termination factor) – терминирует транскрипцию PMID: 17189185 • TFEM (transcriptional elongation factor mitochondrial) - ↑ процессивность POLRMT 3

РНК-полимераза POLRMT • имеет высокую степень гомологии с РНК-полимеразой Т-нечетных фагов (Т 3/Т 7) • не имеет гомологии с мультисубъединичными РНКполимеразными комплексами прокариот. PMID: 22551784 4

У человека POLRMT - белок размером 1230 ак, 134 к. Да. В отличие от фаговой полимеразы, POLRMT не может инициировать транскрипцию самостоятельно, ей требуются дополнительные белки 5

PMID: 22551784 N-концевой домен NTD имеет слабо выраженную гомологию с T 7 РНК-полимеразой. Но структурное сходство высокое. N-концевой домен NTE есть только в POLRMT. Он состоит из: • pentatricopeptide repeat domain (PPR domain) • протяженного участка с неизвестной структурой – остатки 42– 217 • «митохондриального адреса» Короткий богатый пролином линкер соединяет NTE и NTD Каталитический домен СТD 6

PMID: 22551784 СТD – каталитический домен: 12 консервативных блоков расположенных линейно (A-L) Кристаллическая структура: напоминает кисть руки • Пальцы – основной элемент О-helix=мотив В, важен для субстратной специфичности, катализа и транслокации. Расположена немного в разной ориентации. • Ладонь – мотивы А, С, мутации приводят к потере каталитической активности • Большой палец – α-спираль, осуществляет связь полимеразы с матрицей во время элонгации 7

PMID: 22551784 Домен Пальцы • Нет finger flap – стабилизирует фермент на ДНК во время элонгации. Возможно для POLRMT нужны дополнительные факторы для увеличения процессивности. TFEM ↑ процессивность (нокаут - ↓ колво удаленных от промотора транскриптов), взаимодействует с CTD, похож на TEF эукариот и прокариот. • Specificity loop – нет в кристаллической структуре, узнает промотор 3 - -11 и взаимодействует с большой бороздкой ДНК, обеспечивая специфичность узнавания промотора наряду с NTD, участвует также в элонгации, ↑ процессивность. Вероятно, есть и в POLRMT (у дрожжей есть похожая структура, но обеспечивает инициацию 8 только на оц матрице, на дц требуются дополнительные факторы).

NTD PMID: 22551784 • нет сходства последовательности, а структура похожа: 6 спиралей • β-hairpin – вставлена между матричной и нематричной цепью, расплавляя промотор для инициации в Т 7. В POLRMT возможно роль та же, но требуются дополнительные факторы. Делеция в этой области не дает POLRMT инициировать транскрипцию с дц промотора. • AT-rich loop соединяет спирали D и E. Эти 2 спирали и петля имеют плотный контакт с PPR-доменом NTE. АТ-петля взаимодействует с малым желобком ДНК в области -13 - -17, это необходимо для 9 узнавания промотора.

PMID: 22551784 NTE уникален для POLRMT вариабелен у животных, растений и грибов. PPR (pentatricopeptide repeat domain) • Содержит 2 PPR тандемных мотива. В дрожжах этого домена нет, есть у растений. • Образует 9 α-спиралей, из которых 4 включают в себя PPR-мотивы. 10

PPR-мотивы содержатся во многих белках митохондрий и хлоропластов PMID: 22051507 • PPR мотив: 35 аминокислот, образующих 2 альфаспирали • РРR мотивы повторяются от 2 до 26 раз • PPR мотив, вероятно, участвует в связывании с РНК, но 11 механизм этого взаимодействия неизвестен

1. LRPPRC (leucine-rich pentatricopeptide repeat containing protein) участвует в регуляции транскрипции 2. MRPP 3 (mitochondrial RNAse P protein 3) – компонент РНКазы Р, участвует в процессинге 5’– концов т. РНК 3. MRPS 27 (mitochondrial ribosomal protein of the small subunit 27) – компонент малой субъединицы рибосом 4. POLRMT – каталитическая субъединица РНКполимеразы 5. PTCD 1 (pentatricopeptide repeat domain protein 1) - участвует в процессинге 3’– концов т. РНК 6. PTCD 2 (pentatricopeptide repeat domain protein 2) – участвует в процессинге м. РНК 7. PTCD 3 (pentatricopeptide repeat domain protein 3) – связан с 12 S р. РНК, не влияет на её стабильность и процессинг, функции неизвестны. 12

PMID: 22551784 Участок 42 -218 ак – структура не известна, к PPR примыкает α-спираль. Делеция приводит к потере транскрипции с промотора, каталитическая активность сохраняется. 13

РНК-полимераза POLRMT PMID: 22551784 Способна осуществлять транскрипцию только в присутствии TFAM и одного из транскрипционных факторов: TFBM 1 или TFBM 2 14

• TFAM – регулирует число копий мт. ДНК и участвует в регуляции транскрипции. • TFBM 1 (h-mt. TFB 1) и TFBM 2 (hmt. TFB 2) имеют сходство с р. РНКметилтрансферазами, которые диметилируют аденозин около 3’конца 12 S p. РНК. Эта модификация консервативна для про- и эукариот, за исключением дрожжей. TFAM PMID: 17189185 Филогенетический анализ показал, что они происходят от р. РНК метилтрансферазы эндосимбионта. • TFBM 1 и TFBM 2 способны связывать РНК или оц. ДНК. 15

TFB 1 M и TFB 2 M диметилируют А 936 и А 937 в 12 S r. RNA Отсутствие TFB 1 M: PMID: 22642575 • приводит к потере диметилирования • снижает уровень 12 S r. RNA • ведет к невозможности трансляции в митохондриях. 16

TFB M 1 имеет 2 функции: • Участвует в транскрипции (не ясно как именно) • р. РНК-метилтрансфераза (MT) Мутации в МТ-мотиве не приводят к отсутствию транскрипции in vitro. Нокдаун TFB M 1 с помощью i. RNA у дрозофилы не меняет число транскриптов, но ↓ синтез белка в митохондриях => TFB M 1 участвует в трансляции TFB M 1 играет роль транскрипционного фактора в неких специфических условиях или при транскрипции только определенных м. РНК. 17

TFBM 2: • р. РНК-метилтрансферазная активность менее выражена • Специализированный транскрипционный фактор: нокдаун с помощью i. RNA у дрозофилы ↓ число транскриптов в 2 -8 раз. Возможны 2 функции: • Связывает оц. ДНК, стабилизируя область промотора в частично расплетенном состоянии во время инициации транскрипции • Связывает новую цепь РНК, предотвращая образование ДНК-РНК гибридов, способных ингибировать промотор. 18

1. TFBM 1 (h-mt. TFB 1) и TFBM 2 (h-mt. TFB 2) – р. РНКметилтрансферазы, диметилирующие аденозин около 3’-конца 12 S p. РНК 2. TFBM 1 и TFBM 2 являются транскрипционными факторами, POLRMT может осуществлять транскрипцию только в комплексе с одним из них 3. Нокдаун TFBM 1 не влияет на транскрипцию, но существенно снижает уровень трансляции 4. Нокдаун TFBM 2 снижает уровень транскрипции. 5. Основная функция TFBM 1 – метилирование 12 S p. РНК и регуляция трансляции 6. Основная функция TFBM 2 – участие в транскрипции 19

TFAM – регулирует число копий мт. ДНК и участвует в регуляции транскрипции. • TFAM высоко консервативен: 77% гомологии у человека и мыши • У человека состоит из 246 ак, 25 к. Да • 23% составляют + аминокислоты. 20

Доменная структура TFAM: • Mitochondrial Targeting Sequence (MTS) • HMG (High mobility group) box I • linker • HMG box 2 • C-terminal tail - нет гомологии ни с одной из известных последовательностей 21

TFAM (transcription factor A). HMG (High mobility group) box: 3 спирали и 2 петли, формирующих L -структуру. PMID: 22037171 Она связывается с малым желобком ДНК, изгибая ее. 22

TFAM – транскрипционный фактор, стимулирующий активность POLRMT на двух промоторах: LSP и HSP 1, связывается с ДНК upstream от промотора. Его уровень направленно регулирует транскрипцию комплексами TFBM 1/POLRMT и TFBM 2/POLRMT in vitro. 23

Связывание TFAM с ДНК: TFAM способен связываться как со специфичными промоторными последовательностями, так и с неспецифическими последовательностями ДНК. В низких концентрациях TFAM лучше связывается с промоторами LSP и HSP 1, чем с неспецифической ДНК, и с LSP лучше, чем с HSP 1. Разница нивелируется делецией С-конца. PMID: 22037171 Изгибает ДНК промоторов одинаково, и лучше, чем неспецифическую ДНК, изгиб зависит от наличия С-конца. С LSP связывается сильнее. При низких концентрациях TFAM активирует LSP, по мере возрастания концентрации включает 24 и HSP 1.

Мутанты TFAM (не в С-конце), которые связываются с LSP, но слабо сгибают ДНК, сильно снижают транскрипцию с LSP => TFAM должен изогнуть ДНК в области промотора для начала транскрипции. PMID: 22037171 25

Кооперативность связывания TFAM: Одна молекула TFAM стимулирует присоединение следующей, при этом меняется локальная структура ДНК. Для этого важен С-конец. PMID: 22465614 26

Мультимеризация TFAM: Способен к гомодимеризации. Данные противоречивы: мономер или димер? • Взаимодействует с промоторами и с неспецифической ДНК в форме димера, при наличии С-хвоста. • При кристаллизации связан с LSP в форме мономера. PMID: 22465614 27

TFAM упаковывает мт. ДНК в нуклеоидах: При ↑ соотношения TFAM: ДНК ↓ доступность ДНК для ферментов и транскрипционных факторов: ДНК метилтрансфераза снижает доступ к ДНК при гиперэкспрессии TFAM, ↑ соотношения TFAM: ДНК ингибирует транскрипцию. Уровень TFAM регулирует состояние нуклеоида: • Репликация ДНК идет при низкой концентрации • Экспрессия (транскрипция+трансляция) происходит при среднем уровне TFAM • «Молчащий» геном наблюдается при высоком уровне PMID: 22465614 28

Регулирование числа копий мт. ДНК TFAMом Существует 2 гипотезы: 1. Высокая частота связывания TFAM с LSP увеличивает инициацию репликации. POLRMT создает на LSP затравки для репликации. TFAM стимулирует транскрипцию с LSP в меньшей концентрации, чем нужна для активации HSP 1. Ori b Количество TFAM на 1 копию мт. ДНК: 50 молекул в клетках He. La 35 молекул в HEK 293 LSP при этом занят на 85%, HSP 1 – на 35%. 29

2. Неспецифическое связывание TFAM по всему геному стабилизирует количество копий мт. ДНК При гиперэкспрессии TFAM с делецией С-конца в клетках с нокдауном эндогенного TFAM уменьшается активация транскрипции, но увеличивается число копий мт. ДНК. Количество TFAM на 1 копию мт. ДНК: 900 -1600 молекул => TFAM может быть связан с мт. ДНК по всей длине через каждые 35 -36 нуклеотидов. Связывание TFAM с ДНК – динамичный процесс: TFAM способен полностью блокировать ДНК, но в то же время его связь с ДНК лабильна и обеспечивает регуляцию транскрипции. . 30

Basal transcriptional activity - no TFAM PMID: 22465614 31

Активность TFAM должна четко регулироваться TFAM уничтожается протеазой Lon. Известны посттрансляционные модификации: гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование и убиквитинилирование

Фосфорилирование и протеолиз – основные пути регуляции работы TFAM Протеаза Lon регулирует соотношение TFAM: ДНК в митохондриях: PMID: 23201127 • Нокдаун Lon увеличивает уровень TFAM и число копий мт. ДНК • Гиперэкспрессия Lon снижает уровень TFAM и количество мт. ДНК 33

Фосфорилирование и протеолиз – основные пути регуляции работы TFAM фосфорилируется внутри HMG box 1 (HMG 1) c. AMPзависимой протеинкиназой PKA. Это фосфорилирование ухудшает способность TFAM связывать ДНК и активировать транскрипцию. Только свободный от ДНК TFAM (DNA-free TFAM) уничтожается протеазой Lon. PMID: 23201127 34

1. TFAM связывается с ДНК как неспецифически, так и со специфичными промоторными последовательностями 2. При связывании с TFAM ДНК изгибается 3. TFAM – транскрипционный фактор, стимулирующий активность POLRMT на промоторах HSP 1 и LSP 4. При низких концентрациях TFAM активирует LSP, по мере возрастания его концентрации включается HSP 1 5. TFAM должен изогнуть ДНК в области промотора для начала транскрипции 6. Уровень TFAM регулирует состояние мт ДНК в нуклеоиде: репликация идет при его низкой концентрации, экспрессия генов происходит при среднем уровне TFAM, «молчащий» геном наблюдается при его высоком уровне 7. Фосфорилирование и протеолиз – основные пути регуляции работы TFAM 35

Терминация транскрипции PMID: 22137970 • Транскрипт Н 1 терминируется внутри t. RNA Leu • Транскрипт L – вероятно, также терминируется внутри t. RNA Leu • Транскрипт Н 2 - точное место терминации неизвестно Терминация транскрипции осуществляется m. TERF 1. 36

MTERF 1 (mitochondrial termination factor) – белок 39 к. Да • содержит 8 Mterf мотивов и дополнительный искаженный Сконцевой мотив PMID: 20550934 Между двумя соседними спиралями расположены гидрофобные ак (D). 37

MTERF связывается вдоль большой бороздки ДНК. Это приводит к изгибу ДНК на 25 о. Затем концы ДНК вновь принимают В-конформацию, а центральная часть молекулы расплетается. Три нуклеотида – А на L-цепи и С и Т на Н-цепи «выворачиваются» из дц. ДНК, они стабилизируются в таком состоянии тремя ак MTERF 1: R 162, F 234, Y 288. PMID: 20550934 38

«Вывернутые» нуклеотиды стабилизированы дополнительно Н-связями с азотистыми основаниями и фосфатными группами. Мутантный MTERF 1 (по R 162, F 234, Y 288) связывается с ДНК (В), но «вывернутые» нуклеотиды нечем стабилизировать => только 1 нуклеотид – С остается вне цепи, хотя и в другой конформации. Из трех аминокислот R 162, F 234, Y 288, только R 162 консервативен => у других видов механизм связывания MTERF 1 с ДНК может быть другим. PMID: 20550934 39

MTERF 1 связывается с ДНК неспецифично: за счет электростатических взаимодействий между фосфатными группами и положительно заряженной поверхностью белка. За счет чего происходит специфичное связывание с сайтом терминации? 40

MTERF 1 связывается с ДНК неспецифично, но «вывертывание» 3 х нуклеотидов происходит только в результате узнавания специфической последовательности. Мутантный MTERF 1 (по R 162, F 234, Y 288) связывается с сайтом терминации хуже wt. MTERF 1, и примерно с такой же аффинностью как wt. MTERF 1 связывает неспецифичную дц. ДНК => «вывертывание» нуклеотидов – результат специфичности связывания. Вывертывание нуклеотидов не определяет специфичность, а только 41 стабилизирует связывание.

Специфичность определяется Н -связями 5 ти Arg MTERF 1 с большим желобком ДНК. И Arg, и нуклеотиды, с которыми они взаимодействуют, консервативны в MTERF 1 и мт. ДНК соответственно. В других MTERF Arg не консервативны. 42

MTERF 1 способен связываться с неспецифической последовательностью ДНК. Но «вывертывание» нуклеотидов, способствующее высокой аффиности связывания, происходит только при узнавании специфической последовательности – сайта терминации. PMID: 20550934 43

MTERF 1 способен инициировать транскрипцию in vitro Дополнительный сайт терминации найден в HSP 1, он важен для инициации транскрипции in vitro PMID: 22137970 Предложена модель: связывание с MTERF 1 приводит к образованию петли между этим сайтом в HSP 1 и каноническим сайтом терминации в конце гена 16 S р. РНК. Эта петля позволяет POLRMT и другим транскрипционными факторам вновь связываться с HSP 1, инициируя транскрипцию. Есть предположение, что MTERF 1 может участвовать в инициации транскрипции с HSP 2. 44

PMID: 22137970 In vitro терминация в т. РНК Leu с помощью MTERF 1 двунаправлена: т. е. терминируется синтез транскриптов Н 1 и L. Но терминация транскрипта с LSP гораздо более эффективна. Терминация транскрипта Н 2 происходит upstream т. РНК Phe. Сайт терминации не определен. Известны 2 белка, которые связываются с этим участком. 45

Механизм терминации транскрипции MTERF 1 напоминает механизм терминации репликации у E. coli PMID: 21326908 Фактор терминации Tus связывается с ДНК также выворачивая основания. 46

Терминация транскрипции POLRMT при синтезе праймеров для репликации происходит за счет образования G-квадруплекса на РНК Это напоминает механизм терминации транскрипции бактериофага Т 7: РНК образует т. РНКподобную структуру, полимераза имеет низкое сродство к дц. НК. Вероятно, такой механизм может использоваться и при терминации транскрипции с HSP 2. Не исключено, что MTERF 1 тоже как-то участвует в этом процессе. 47

Структура G-квадруплекса 48

Мутации в сайте связывания MTERF 1 вызывают серьезные митохондриальные заболевания • Замена A 3243 G присутствует в 80% случаев MELAS (Mitochondrial Encephalomyopathy, Lactic Acidosis, Strokelike Episodes). Такая замена несильно влияет на уровень транскрипции с HSP, но нарушает структуру т. РНК Leu. По терминации LSP данных нет. • Замена G 3249 А синдром Kearns-Sayre • Замена G 3242 A – митохондриальная патология неохарактеризованная 49

1. MTERF 1 связывается с ДНК неспецифично 2. MTERF 1 связывается с сайтом терминации с большей аффиностью, чем с неспецифической последовательностью ДНК за счет «вывертывания» нуклеотидов 3. Специфичность связывания MTERF 1 с сайтом терминации определяется взаимодействием 5 ти остатков Arg с несколькими консервативными нуклеотидами 4. MTERF 1 способен инициировать транскрипцию in vitro 5. Мутации в сайте терминации транскрипции вызывают серьезные митохондриальные заболевания 50

Другие белки семейства MTERF • MTERF 1 и MTERF 2 уникальны для Позвоночных • MTERF 3 и MTERF 4 есть не только у Позвоночных, но и у Беспозвоночных животных (червей и насекомых) • MTERF 1 -3 участвуют в транскрипции, а MTERF 4 участвует в трансляции. 51

MTERF 2 • гиперэкспрессия ингибирует рост клеток • связывается с ДНК неспецифически и присутствует в нуклеоидах Нокаут в мыши: дефекты в дыхательной цепи при переходе с высокоуглеводной на низкоуглеводную диету: ↑ уровня большинства м. РНК и т. РНК и ↓ трансляции некоторых белков. На стандартной диете – нормальный уровень всех РНК, кроме ↑ т. РНК ближних к промотору и ↓ т. РНК дальних от промотора => MTERF 2 позитивный регулятор транскрипции. Нокаукт также ↑ число копий мт. ДНК => MTERF 2 может быть регулятором репликации 52

MTERF 3 PMID: 20430012 структура похожа на MTERF 1. Но в MTERF 3 есть только 1 Arg из пяти, необходимых для специфичного связывания с ДНК и только одна из трех аминокислот, необходимых для стабилизации вывернутых оснований. Нокаут в мыши: летален у эмбрионов, т. к. сильно изменен уровень транскрипции и соотношение разных транскриптов. MTERF 3 регулятор транскрипции. 53

MTERF 4 Важен для эмбрионального развития мыши. Нокаут приводит к изменению уровня транскрипции, а также к ослаблению трансляции и дефектам в сборке рибосом. PMID: 22642575 Связывает 16 S р. РНК и формирует комплекс с мт р. РНК метилтрансферазой, необходимый для вставки 16 S р. РНК в большую субъединицу рибосом. Возможно, осуществляет направленную связь между транскрипцией и трансляцией. 54

PMID: 22120174 • POLRMT- РНК-полимераза, проводит транскрипцию и синтезирует праймеры для ДНК-полимеразы • TFAM (h-mt. TFA –transcription factor A) – регулирует число копий мт. ДНК и участвует в регуляции транскрипции. • TFBM 1 (h-mt. TFB 1) – р. РНК-метилтрансфераза (MT), участвует в регуляции трансляции, транскрипционный фактор • TFBM 2 (h-mt. TFB 2) – транскрипционный фактор, образует гетеродимер с POLRMT, р. РНК-метилтрансфераза (MT) • TFEM (transcriptional elongation factor mitochondrial) - ↑ процессивность POLRMT 55 • MTERF 1 (mitochondrial termination factor) – терминатор транскрипции