Helicobacter pylori inflammation chronique et cancer gastrique Hilde

Helicobacter pylori, inflammation chronique et cancer gastrique Hilde de Reuse (hdereuse@pasteur. fr) Unité de Pathogenèse de Helicobacter Institut Pasteur, PARIS

Jusqu’en 1983, on pensait que l’estomac était un organe stérile et que les ulcères de l’estomac étaient causés par le stress p. H median de l’estomac = 2

Anciennes observations de bactéries dans l’estomac. . . 1886 : identification de bactéries spiralées dans des lavages gastriques humains par Walery Jaworski (Université de Cracovie) 1893 : description de bactéries spiralées dans l’estomac d’un chien par Giulio Bizzozero (Université de Padoue)

Ces observations ne montrent pas que la bactérie cause une maladie

En 1983 - le travail exemplaire de deux médecins australiens, R. Warren et B. Marshall 1) Analyse de biopsies de l’estomac de 135 patients souffrant de gastrite et de biopsies de patients sains => identification d’une bactérie spiralée uniquement chez les patients souffrant de gastrite 2) Culture de cette bactérie pure in vitro 3) Barry Marshall démontre l’un des postulats de Koch en avalant une culture de cette bactérie qu’ils appellent Helicobacter pylori

2005: R. Warren et B. Marshall Prix Nobel de Médecine pour la démonstration du rôle de la bactérie Helicobacter pylori dans le développement des maladies de l’estomac

La bactérie Helicobacter pylori • Gram négatif • Classe des epsilon protéobactéries • Spiralée et fortement mobile H. pylori colonise exclusivement l’estomac des humains et des primates non-humains • Helicobacter pylori : chef de file d’un nouveau genre bactérien

Helicobacter pylori chef de file d’un nouveau genre bactérien

Infections par Helicobacter pylori

- très forte prévalence, la moitié de la population humaine mondiale - fortes disparités géographiques (niveau socio-économique)

Epidémiologie de l’infection par Helicobacter pylori Mode de transmission : - inter-humaine - acquisition par voie oro-orale - acquisition au cours de la petite enfance - transmission le plus souvent intrafamiliale - infection persiste souvent toute la vie

Prévalence des infections à H. pylori Dans les pays occidentaux => l’incidence diminue - 66 % de la population de l’âge de 60 ans est infectée - 22 % de la population de l’âge de 20 ans est infectée Effet cohorte

Pathologies associées à l’infection par H. pylori <1 a Infection par H. pylori 20 -30 a Gastrite chronique (100%) Asymptomatique (80%) Gastrite atrophique Dyspepsie fonctionnelle Ulcères gastriques ou duodénaux (10%) (5 -10%) 30 -50 a Métaplasie intestinale Lymphome du MALT (0. 3%) Dysplasie Adénocarcinome (1 -3%) 65 -80 a

Facteurs de l’environnement et mode de vie de l’hôte Caractéristiques génétiques de l’hôte Polymorphismes des cytokines pro-inflammatoires -> TNF et IL 1 β (puissant inhibiteur de la sécrétion acide gastrique) Risque accru d'atrophie gastrique et d'adénocarcinome Génotype de la bactérie (îlot de pathogénicité Cag, Vac. A-s 1 m 1)

Traitements des infections à Helicobacter pylori • Trithérapie de 7 jours : combinaison de deux antibiotiques parmi (Amoxicilline, clarithromycine, tétracycline, métronidazole) + inhibiteur de Pompe à Protons (IPP) • Nouveaux traitements (90% éradication) - séquentiel - IPP, Tetracycline, Metronidazole, Bismuth • Apparition préoccupante de souches résistantes Souches isolées de 530 biopsies (2004 -2007, France) 26% clarithromycine. R 61% métronidazole. R 0% amoxicilline. R (Raymond et al. Helicobacter 2010)

Helicobacter pylori et cancer gastrique 1994 : reconnaissance internationale de H. pylori comme oncogène de classe I par l’agence internationale de recherche sur le cancer (IARC)

Cancers associés aux infections Nombre total de cancers attribuables aux infections en 2002 : - 1. 9 million de cas dans le monde - 18% de l’ensemble des cancers Principaux agents impliqués : Bactérie : Helicobacter pylori 5. 5% Virus : Papilloma Virus humains 5. 2% Virus des Hépatites B & C 4. 9% Virus d’Epstein-Barr 1% VIH & HHV 8 0. 9% HTL Virus 0. 03% Parasites du foie : 0. 02% cancers gastriques (Parkin, Int J Cancer 2006)

Le cancer gastrique en chiffre • 600 000 nouveaux cas/an dans le monde • 2ème cause de mortalité par cancer dans le monde (2/3 des cas dans pays en voie de développement) • 800 000 morts par an dans le monde • En France : 6 000 nouveaux cas/an • Survie à 5 ans : 10 -15 % • Cancers gastriques associés à H. pylori 90 % des lymphomes gastriques de type MALT 71 % des adénocarcinomes gastrique distaux (de type intestinal ou diffus)

- Suivi longitudinal sur 10 ans de 1526 patients japonais • Sur les 280 patients non-infectés par H. pylori ou infectés et traités aucun n’a développé de cancer • Sur 1246 patients infectés par H. pylori * 36 patients ont développé un cancer (2, 9%) * 4, 7 % Dyspeptiques 3, 5 % Ulcères gastriques 2, 2 % Polypes gastriques 0 % Ulcères duodénaux Uemura et al. N. Engl. J. Med. (2001)

Comment l’infection par H. pylori conduit au cancer gastrique ? Processus très long (>40 ans) multifactoriel - mécanismes encore mal compris. • H. pylori provoque une réponse inflammatoire chronique au niveau des cellules épithéliales de la muqueuse gastrique => conduit à des lésions de l'ADN (espèces réactives de l'oxygène et de l'azote). • H. pylori provoque l'augmentation de l'enzyme AID, une cytidine deaminase responsable de l"editing" d'ADN => génère l'accumulation de mutations dans TP 53. (Matsumoto et al. Nature Med 2007) • L'infection par H. pylori diminue l'expression de certaines enzymes de réparation de l'ADN. (Machado et al, Clin. Canc Res 2009) • H. pylori exprime des facteurs de virulence dont les activités augmentent le risque d'oncogenèse (Vac. A et Cag. A).

Activités de la cytotoxine Vac. A Domaine autotransporteur Séquence signal s i m s 1 s 2 i 1 i 2 m 1 m 2 Vacuolisation Affaiblissement des jonctions intracellulaires Formes plus fréquemment associées avec le cancer gastrique p 33 p 55 Libération cytochrome C Induction de l'apoptose Activité immuno-suppressive : évasion de la réponse immunitaire adaptative (D'après Polk and Peek, Nature Reviews Cancer, 2010) Inhibition de la fusion phagosome-lysosome Macrophages Altération de la capacité à présenter les antigènes Lymphocytes B Integrin ß 2 Inhibition de l'activation et de la prolifération Cellules T IL-2

L'îlot de pathogénicité Cag cag. A 30 gènes - Ilot Cag : acquis par transfert horizontal de gènes, H. pylori Membrane interne présent dans : • 50 % des souches européennes • >95% des souches asiatiques - souches Cag+ = facteur de risque pour le cancer gastrique : cancer => 95% Cag+ gastrite non-atrophique => 40 % Cag+ - Contient 22 gènes requis pour la synthèse d'un système de sécrétion de type IV (SST 4) 40 kb Membrane externe Cellule épithéliale

Cag. A, une molécule pro-oncogène injectée par le SST 4 Cag H. pylori récepteur intégrines 5 ß 1 Cellule épithéliale Cag. A SRC P ABL fragments de PG Viala et al. Nature Immunol. 2004 Activation de NF-k. B => Stimulation de la transcription de la cytokine pro-inflammatoire IL-8 Nod 1 Cag. A SHP 2 SST 4 CSK P ale at Activ - Remaniement du cytosquelette (augmentation de la mobilité et élongation cellulaire) - Prolifération cellulaire Cag. A orm n an io ß-catenin Hyperprolifération et différentiation aberrante ZO-1 Cag. A JAM Perturbation - des jonctions serrées et adhérentes - de la polarité cellulaire Rôle(D'après Polk and Peek, dans la transformation des cellules épithéliales gastriques du SST 4 Cag Nature Reviews Cancer, 2010)

Effet de l’éradication de H. pylori sur le développement du cancer gastrique • Traitement du MALT: 80 % de régression après éradication de H. pylori • Effet bénéfique de l'éradication de H. pylori sur l'évolution des lésions pré-néoplasiques (Méta-analyse par Rokkas et al. Helicobacter 2007) Atrophie gastrique Gastrite chronique Amélioration dans l'antre et le corps Atrophie gastrique Métaplasie intestinale Aucune amélioration Point de “non-retour” ? Métaplasie intestinale Dysplasie Adénocarcinome

Conclusions • Helicobacter pylori : une bactérie de découverte récente responsable de diverses pathologies de l'estomac chez l'homme. • H. pylori colonise de manière persistante la moitié de la population humaine mondiale (800 000 morts/an). • H. pylori = la seule bactérie reconnue comme oncogène de classe 1 (MALT et adénocarcinome). • Adénocarcinome apparaît après des décades d'infection par H. pylori – mutagenèse de l'ADN des cellules hôtes (inflammation, AID). – diminution de l'expression de facteurs de réparation de l'ADN. – expression de facteurs de virulence (Vac. A et Cag) qui augmentent le risque d'oncogenèse. • L'éradication de H. pylori fait régresser le MALT et elle est bénéfique pour l'évolution des lésions pré-oncogènes.

H. pylori possède des propriétés uniques qui lui permettrent de survivre et de se multiplier à long terme dans l’estomac, un organe pourtant hostile. . .

Barrière chimique : acidité p. H médian : 2 p. H 4. 5 -6 Barrière physique : mucus très épais p. H neutre cellules épithéliales Adapté de Tortora, Funke and Case "Microbiology, an introduction" editeur Pearson Barrière biologique : réponse immunitaire

Barrière immunologique Motifs Lewis : mimétisme moléculaire Immuno-suppression

Barrière physique : mucus très épais Forme spiralée pour pénétrer dans le mucus Flagelles pour se déplacer dans le mucus

Barrière chimique : p. H très acide H+ H+ Uréase 2 NH 3 + CO 2 H+ NH 2 -C-NH 2 + H 2 O = H+ O NH 4+

Urease : un facteur de virulence majeur de H. pylori - Enzyme essentielle pour la résistance à l'acidité, indispensable à la colonisation de modèles animaux - Urease : 10% protéines totales de H. pylori - Uréase de H. pylori, la plus active de toutes les uréases décrites (Km=0, 2 -0, 5 m. M) - Au niveau des cellules épithéliales gastriques de l'hôte - l'ammoniac produit par H. pylori est cytotoxique - la présence d'ammoniac accélère l'induction de l'apoptose induite par la cytokine TNF

Urease : une métalloenzyme à nickel Ni 2+ 24 nickel ions par complexe actif d'uréase [(Ure. A-Ure. B)3]4

Uréase : une arme à double tranchant - à p. H acide : activité indispensable à la survie de H. pylori - à p. H neutre : production d'ammoniac délétère car conduit à un p. H alcalin toxique pour H. pylori Ni 2+

Tests de la réponse de H. pylori à l'acidité in vitro 2 x 108 bact. /ml PBS p. H 7. 0 H. pylori PBS p. H 2 + 10 m. M urée PBS p. H 7. 0 + 10 m. M urée 37°C - 1 H p. H Compte-viable des bactéries

Incubation sans urée p. H initial Incubation avec urée p. H initial p. H final Toxique p. H = 9 p. H = 7 p. H = 6. 5 108 CFU/ml p. H = 2 1 H Nécessité pour la bactérie de contrôler son activité uréase

Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori Identification de mécanismes originaux - Accessibilité de son substrat, l'urée - Transport de son co-facteur, le nickel - Incorporation du nickel dans son site actif - Stockage du nickel

Urée H+ Ure. I Canal à urée Urée P ure. A ure. B ure. I ure. E ure. F ure. G ure. H Sous-unités catalytiques Protéines accessoires Ni 2+ Ure. HEFG (Ure. A-Ure. B)6 Construction d'un mutant de H. pylori ure. I -> activité uréase identique à celle de la souche sauvage (sur des lysats) Skouloubris et al. Infect & Immun 1998 Bury-Moné et al. Mol Microbiol 2001 et 2004

Incubation avec urée p. H initial p. H final p. H initial p. H = 9 p. H = 7 p. H = 6. 5 108 CFU/ml p. H = 2 1 H Souche de H. pylori sauvage 9 8 7 p. H = 7 6 5 4 3 p. H = 2 1 0 p. H final p. H = 9 p. H = 2. 5 105 CFU/ml 0 1 H 1 Mutant de H. pylori ure. I Ure. I est nécessaire pour la survie de H. pylori à p. H acide en présence d'urée Démonstration du transport de l'urée à p. H acide par Ure. I dans un système hétérologue (oocytes de Xénopes) Weeks et al. 2001

Inoculation par voie orogastrique de 109 bactéries (souche SS 1) 0 1 2 3 108 4 semaines 107 (CFU/g estomac) Charge bactérienne Sacrifice 109 106 105 104 103 H. pylori sauvage H. pylori ure. I Contrôle négatif 102 101 0 0 2 7 10 14 20 28 jours Compte-viable (Skouloubris et al. I&I 1998) La protéine Ure. I est essentielle pour la colonisation d'un modèle animal par H. pylori

H+ H+ Urée Ure. I Urée H+ H+ H+ NH 4+ NH 3 + CO 2 Uréase Ure. I = canal à urée dans la membrane interne de la bactérie ouvert uniquement à p. H acide (cible thérapeutique - brevet)

Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori Identification de mécanismes originaux - Accessibilité de son substrat, l'urée - Transport de son co-facteur, le nickel - Incorporation du nickel dans son site actif

L'acquisition des métaux par les bactéries pathogènes au sein de leur hôte est un élément de virulence Nickel Il est essentiel pour Helicobacter pylori de se procurer du nickel dans l’estomac de son hôte

Acquisition du nickel par H. pylori Environnement gastrique : - complexe et varié - biodisponibilité des ions métalliques ? Concentration du nickel dans le corps humain est très faible : 2 -11 n. M MI ME ? Ni 2+ Nix. A Comment le nickel est-il transporté à travers la membrane externe (ME) ? Aucune source d'énergie disponible au niveau de la ME

Le complexe Ton. B/Exb. D fournit de l'énergie pour le transport à travers la membrane externe (ME) en utilisant la force proto-motrice de la membrane interne (MI) Transporteur Substrate-binding site dépendant de Ton. B = TBDT ME Substrats du système Ton. B : • Fer chélaté (sidérophores) • Cobalamin, vitamine B 12 (cofacteur cobalt) MI Modified from Braun & Braun

La machinerie Exb. B/Exb. D/Ton. B est impliquée dans le transport du fer chez H. pylori Question: est-ce que Ton. B est requis pour le transport énergisé du nickel ? Kristine SCHAUER

Mesures du contenu intracellulaire en nickel par la technique de "Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry" (ICP-MS) µmol Ni 2+ /g prot Ni 2+ p. H 7 p. H 5 mutant ∆exb. B-exb. D-ton. B + mutant complémenté • A p. H 7, peu de nickel accumulé indépendamment de Ton. B • A p. H 5, augmentation de l'accumulation du nickel, dépend de Ton. B

Identification du transporteur Ton. B-dépendant Frp. B 4 Ø présente les caractéristiques d'un TBDT Ø localisée dans la membrane externe (Ernst et al. 2006 J. Bact) Ø régulée par Nik. R en réponse au nickel (Muller et al. 2011 NAR) Mutant ∆frp. B 4, même phénotype que le mutant ∆exb. B-D-ton. B Modified from Braun & Braun

Conséquences du transport du nickel Ton. B-dépendant sur l'activité uréase p. H 7 A p. H 7, accumulation du nickel Ton. B-indépendante => activation de l'uréase p. H 5 A p. H 5, à des faibles doses de nickel => Machinerie Exb. B/Exb. D/Ton. B + Frp. B 4 nécessaires à l'activité uréase

Première démonstration d'un transport du nickel à travers la ME par un mécanisme dépendant de la machinerie Ton. B Nickel H+ ME • Frp. B 4 = Transporteur de nickel dépendant de Ton. B Frp. B 4 • Transport de nickel est activé à p. H acide Ton. B H+ Exb. B MI Exb. D Nix. A • Activation de l'uréase à p. H acide par l'apport de nickel PMF Schauer et al. Molec Microbiol (2007) Uréase Schauer, Rodionov et al. TIBS (2008)

Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori Identification de mécanismes originaux - Accessibilité de son substrat, l'urée - Transport de son co-facteur, le nickel - Incorporation du nickel dans son site actif

Incorporation du nickel dans l'uréase par des complexes protéiques • Carte génomique d'interaction protéiques par paires (Y 2 H) Nature (2001), Mol Microbiol (2001), NAR (2003) • Purification de complexes protéiques par la technique TAP, Tandem Affinity Purification (Kerstin STINGL) • Purification de complexes multiprotéiques à partir de l'organisme d'origine => Meilleure spécificité des complexes (moins de faux positifs)

Recherche de complexes protéiques associés à l'uréase chez H. pylori par TAP

Identification de deux populations de complexes - un complexe enzymatique actif associé à des enzymes du métabolisme de NH 3 - un complexe d'incorporation du nickel partagé avec celui de l'hydrogénase (distribution du nickel) Urease Ni 2+ Complexes protéiques pour l'incorporation du nickel 2+ Ni Hydrogenase

Ni 2+ Frp. B 4 Ton. B-Ex. BD Nix. A Ni 2+ Urée H+ Urée Nouveaux mécanismes pour l'acquisition du nickel, activés à bas p. H Ure. I Complexes protéiques pour l'incorporation du nickel Urease H+ Canal à urée activé à p. H acide Hydrogenase

Helicobacter pylori est une bactérie fascinante ! - il reste beaucoup d’aspects de sa virulence à comprendre - elle constitue un bon système d’étude * pour comprendre les processus qui conduisent au cancer * pour identifier de nouveaux mécanismes ou de nouvelles fonctions dont certains peuvent être communs à d’autres bactéries pathogènes

Pour en savoir plus sur H. pylori http: //www. helicobacter. fr. /

Sylvie AUBERT ERL 3526 Julien GALLAUD Daniel VINELLA Yulia REDKO Karine ANGER Valérie MICHEL Eliette TOUATI Julien FERNANDES Hilde DE REUSE Unité Pathogenèse de Helicobacter Mireille FERRAND Mécénat Janssen ODYSSEY-Re

Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux (CEA/CNRS Grenoble) Christelle BALHAWANE Isabelle MICHAUD-SORET Groupe de Cristallographie Macromoléculaire (ESRF Grenoble), now at IBCP Lyon Cyril DIAN Laurent TERRADOT Burnham Institute, La Jolla USA Dmitry RODIONOV Laboratoire de Cristallographie et Cristallogenèse des Protéines (CEA/CNRS Grenoble) Christine CAVAZZA Laboratoire CEA de Cadarache DSV/IBEB/SBVME/LB 3 M Pierre RICHAUD Génopole IP (Proteopole) Pascal LENORMAND Jean-Claude ROUSSELLE Abdelkader NAMANE

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