Грибы – продуценты гидролитических ферментов : экологические аспекты, биотехногические применения Кураков А. В. Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова Биологический факультет Кафедра микологии и альгологии kurakov 57@mail. ru
• Гидролазы (КФ 3) — класс ферментов, катализирующий гидролиз ковалентной связи. Общий вид реакции, катализируемой гидролазой : • A–B + H 2 O → A–OH + B–H
Подразделяется на 13 подклассов в зависимости от типа гидролизуемой связи. Подкласс Гидролизуемая связь Важнейшие представители КФ 3. 1 сложноэфирная связь эстеразы: нуклеаза, фосфодиэстераза, липаза, фосфатаза КФ 3. 2 сахара гликозидазы: амилаза, гиалуронидаза, лизоцим и др. КФ 3. 3 простая эфирная связь КФ 3. 4 пептидная связь КФ 3. 5 непептидная углерод-азотная связь КФ 3. 6 кислотный ангидрид КФ 3. 7 углерод-углеродная связь (C-C) КФ 3. 8 галогенная связь КФ 3. 9 азотно-фосфорная связь (P-N) КФ 3. 10 азотно-серная связь (S-N) КФ 3. 11 углеродно-фосфорная связь (C-P) КФ 3. 12 дисульфидная связь (S-S) КФ 3. 13 серо-углеродная связь (C-S) протеазы: трипсин, химотрипсин, эластаза, тромбин, ренин и др. кислотный ангидрид-гидролаза (хеликаза)
ГРИБЫ 1. Способ питания грибов, отличающий их от других эукариотных организмов – всасывание питательных веществ из субстрата (осмотрофный) 2. В связи с этим вегетативное тело большинства грибов представляет собой систему разветвленных нитей (мицелий), погруженных в субстрат. 3. Поскольку органические вещества в субстрате находятся в форме полимеров, грибы выделяют внеклеточные ферменты-деполимеразы, расщепляющие полимеры до олиго- и мономеров. Грибы – источники активных деполимераз.
Бактерии Грибы мочевина аминокислоты нуклеотиды аминосахара пептон легкодоступные белки и нуклеиновые кислоты хитин коллаген пергамент кератин Относительное участие бактерий и грибов в использовании и разложении азотсодержащих органических соединений в почвах
Источники азота для растений N 2 Бобовые с клубеньками Буссенго, 1837 Растения с микоризой помимо минеральных форм, Р, N-содержащие органические в-ва Франк, 1892 Перегной (органические в-ва) NH 4+, NO 3 Либих, 1840
Минерализация органических N-содержащих веществ до аммония – ключевое звено регуляции интенсивности азотного цикла в экосистемах Растения Минерализация/ Аммонификация (регулирует N цикл) Органическое N-содержащее вещество Грибы и бактерии Иммобилизация (конкурирует с поглощением минерального азота растениями) NH 4+ NO 3 - Нитрификация
Внеклеточные ферменты грибов эрикоидной (Эр. М) и эктомикоризы (ЭМ) (Read et al. , 2004). Процесс Субстрат Разложение кутикулы Окисление фенолов и таннинов Кутин, липиды, воск Пектин Целлюлоза Целлобиоза Гемицеллюлоза Монофенолы Полифенолы Гидролиз лигнина Лигнин Разложение белков Белок Разложение растительной клеточной стенки Отщепление органического фосфата Ферменты и ферментные комплексы Эстераза жирных кислот Тип микоризы Полигалактуроназа Целлюлаза Целлобиогидролаза Ксиланаза Тирозиназа Лакказа Катехолоксидаза Пероксидаза Лигназа Mn-зависимая пероксидаза Кислая протеиназа Кислая фосфатаза Фосфодиэстераза ЭМ, Эр. М ЭМ ЭМ, Эр. М ЭМ ЭМ ЭМ, Эр. М ЭМ В ряде случаев результаты были получены косвенными методами – обнаружением гена, ответственного за синтез данного фермента или путем наблюдения усиления роста тестовой культуры при внесении данного субстрата.
Деполимеризация органических соединений азота до мономеров – ключевое звено, регулирующее интенсивность азотного цикла Растения Деполимеризация (регулирует N цикл) Микориза Аммонификация Органические N-содержащие вещества Нитрификация Мономеры Микроорганизмы NH 4+ Стресс и выедание Иммобилизация NO 3 -
Растения, которые поглощали аминокислоты со скоростью сопоставимой или более высокой, чем неорганический азот* Вид Kobresia myosuroides Carex rupestris K. simpliciulscula C. ebenea C. canescens C. rhynchophysa C. stenophylla C. fillifolia Cyperus strigosus C. halpan Hakea sp. Pisonia grandis Betula nana Carex bigelowii Eriophorum vaginatum Ledum palustre Salix pulchra Oryza sativa Zea mays Экосистема Метод Альпийская Субальпиское болото Субальпийский лес Степь Болото (умеренная зона) Сухой тропический лес Субтропический влажный Субтропический коралловый риф Травянистая тундра Кустарнично-травянистая тундра Агроэкосистема 1 1 1 1 1 2 2 2 2 1 1 • - сводка литературных данных (Lipson, Nasholm, 2001); • 1 - растения в растворе (гидропоника); 2 – опыты с удалением надземной части растений.
Лесные сукцессии в зоне умеренного климата, широта/высота над уровнем моря Растения бореальной, арктической, субальпийской зон, хвойные, эрикоидные Тропические деревья, травы, рудералы опад N орг. соединения Эрикоидная/ Эктомикориза Опад и др. орг. остатки опад в Грибы почве и мономеры бактерии NH 4+ Закрытый цикл N Арбускулярная микориза/без микоризы Минерализация Сапротрофные микроорганизмы, грибы Открытый цикл N
Лесные сукцессии в зоне умеренного климата, Закрытый цикл N широта/высота над уровнем моря Растения бореальной, арктической, субальпийской зон, хвойные, эрикоидные Тропические деревья, травы, рудералы опад N орг. соединения Эрикоидная/ Эктомикориза NH 4+ Опад и др. орг. остатки опад в Грибы почве и мономеры бактерии Арбускулярная микориза/без микоризы Тундра Аляски (Betula, Salix, Vaccinium, Eriophorum). На основе измерений 15 N Минерализация показано, что микоризные грибы, такие как Cortinarius Сапротрофные favrei, Сапротрофные растениям поставляют микроорганизмы, 60 -90% азота (J. Hobbie, E. грибы Hobbie, Ecology, 2006 ). Открытый цикл N
Эрикоидные и некоторые эктомикоризные грибы могут мобилизовать азота из относительно легко разлагаемых полимеров (белки, хитин), и стабильных азотных соединений – комплексов аминокислот, аминосахаров, белков с лигнином, танином и монофенолами. Повышенный уровень обеспечения микоризных растений азотом неорганических соединений и свободными аминокислотами обусловлен, главным образом, увеличением адсорбирующей поверхности корневой системы, а из органических веществ активностью гидролитических и окислительных ферментов микоризных грибов и ассоциированных с ними микроорганизмов.
400 Глюкоза 300 Сахароза Крахмал Целлюлоза мкг N/кг почвы ч 350 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 29 36 сутки Активность азотфиксации в дерново-подзолистой почве при внесении различных углеводных соединений
30 мкг N/кг почвы ч 25 20 15 1 10 5 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 11 12 14 18 19 20 21 22 25 Динамика активности азотфиксации в дерново-подзолистой почве при внесении растительных остатков луговых трав без (1) и совместно с циклогексимидом (2).
Азотный баланс почв при монокультуре сахарного тростника Высокий уровень нитрогеназной активности установлен в разрушающихся остатках сахарного тростника. Ежегодно за счет азотфиксации обеспечивается поступление в почву до 40 кг N/га. Ассоциация (с доминантами грибом Helicomyces roseus и азотфиксатором Azospirillum brasilense), развивающаяся на тростнике, обеспечивала в аэробных условиях поступление 6, 6 мг N/г соломы (Hill, Patriquin, 1990). Активная азотфиксация за счет разлагающихся растительных остатков тростника поддерживают азотный статус почв при традиционных системах его многолетнего выращивания.
Облигатно-анаэробные грибы – продуценты гидролаз • “Рубцовые грибы”— открыты в 1977 г. • Облигатно-анаэробные грибы, которые живут в пищеварительном тракте травоядных животных (рубце и заднем кишечнике) • Представители Neocallimastigomycota (M. J. Powell, 2007) - родов Caecomyces, Piromyces sp. Piromyces, Neocalimastix, Anaeromyces, Orpinomyces – ранее cемейство Neocallimasticaсeae отдела Chytridiomycota. Имеют смешанно-кислотный профиль брожения, сходный с энтеробактериями. Превращают гексозы в формиат, ацетат, лактат, сукцинат, этанол, СО 2 и Н 2 (Lowe et al. , 1987). Митохондрии отсутствуют, накопление энергии в АТФ идет в гидрогеносомах (Marvin-Sikkema et al. , 1994). Образуют широкий спектр гидролитических ферментов - целлюлазы, гемицеллюлазы, протеазы, амилогликозидазы, эстеразы, пектиназы (Trinci et al. , 1994).
Болота Грибы активно функционируют только в верхних горизонтах торфяных почв и торфяников (на глубинах 0 – 40 см), где деструкция органических субстратов протекает с максимальной интенсивностью. Ограничение по кислороду ведет к снижению разнообразия грибов, способных к росту в анаэробных условиях, развиваются только факультативно-анаэробные виды. Они нуждаются в легкодоступных сахарах, то есть синтез гидролитических ферментов грибами прекращается. Кроме того, активность фенолоксидаз требует наличия кислорода, а уже синтезированных гидролитических энзимов существенно снижена при наличии в окружающей среде фенольных соединений (Freeman et al. , 2004). Накопление органических веществ в болотах в первую очередь обусловлено прекращением функционирования грибов.
Грибы в биотехнологиях
Определения • Биотехнология интегрированное применение достижений и методов биохимии, микробиологии, других биологических наук и инженерных дисциплин для создания технологических процессов, в которых используются свойства микроорганизмов, культур клеток или их метаболитов (Европейская биотехнологическая федерация, 1981). • Биотехнология направлена на разработку и применение методов и приемов получения полезных для человека продуктов и изменения окружающей среды в соответствии с его потребностями с помощью биологических агентов.
«Цветовая" классификация биотехнологии • «Красная» – биотехнология, связанная с обеспечением здоровья человека и потенциальной коррекцией его генома, производством фармацевтических препаратов (протеинов, ферментов, антител); • «Зеленая» – сельскохозяйственная биотехнология, определяет современные методы ведения сельского и лесного хозяйства, создание генетически модифицированных (ГМ) растений, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам, биопрепаратов, кормов; • «Белая» - промышленная биотехнология, объединяющая производство биотоплива, биотехнологии в пищевой, химической и нефтеперерабатывающей промышленности; • «Серая» - связана с природоохранной деятельностью, биоремедиацией окружающей среды, добычей полезных ископаемых; • «Синяя» биотехнология – связана с использованием морских организмов и сырьевых ресурсов.
Российская Федерация • Перечень технологических платформ по высоким технологиям и инновациям 2015 -2030 гг. • • Медицинские и био- технологии 1. Медицина будущего 2. Биоиндустрия и биоресурсы – Биотех 2030 3. Биоэнергетика • • • Информационно-коммуникационные технологии Фотоника Авиакосмические технологии Ядерные и радиационные технологии Энергетика Технологии транспорта Технологии металлургии и новые материалы Добыча природных ресурсов и нефтегазопереработка Электроника и машиностроение
Грибы в биотехнологиях - органические кислоты, этанол, липиды, белки, внеклеточные полисахариды - антибиотики, иммуномодуляторы, ингибиторы синтеза холестерина, витамины, пигменты, алкалоиды (например, пеницилин, цефалоспорин, ловастатин, циклоспорин, каротиноиды) • Ферменты - амилазы, целлюлазы, ксиланазы, пектиназы, липазы/эстеразы, фитазы, пероксидазы, протеазы и др. - стойких токсичных соединений с • Биоконверсия и использованием цитохрома Р 450, биотрансформация преобразование стеролов, переработка лигноцеллюлозы Биомасса клеток, - Кормовой белково-витаминный мицелия, клеточных концентрат, хитин/хитозан, съедобные стенок культивируемые виды • Живые культуры и - Биопрепараты для нефтеочистки почв, метаболиты в водоемов, биореакторы для очистки растениеводстве и стоков, регуляторы роста, для ремедиации биопестициды, биоудобрения • Первичные метаболиты • Вторичные метаболиты
Грибы в исследованиях и современных прикладных биотехнологиях в экологии и сельском хозяйстве • Грибные препараты для повышения плодородия почв и продуктивности растений. • Фитогормоны, синтетические и микробные регуляторы роста растений. • Применение микоризных и эндотрофных грибов в растениеводстве. • Биотехнологии защиты растений от вредителей. • Биотехнологии защиты растений от болезней и сорняков. • Трансгенные микроорганизмы и растения. • Получение биомассы и биодизеля на органических отходах, субстратах, выбросах диоксида углерода. • Почвенные биотехнологии в земледелии. • Биотехнологии в животноводстве (вакцины, пробиотики, корма) • Биоремедиация загрязненных почв и водоемов • Биологическая обработка отходов, газообразных выбросов и стоков • Биоразлагаемые пластики • Биотехнологии контроля загрязнения объектов окружающей среды и сельскохозяйственной продукции • Биоповреждения материалов, сооружений и подземных коммуникаций и способы их защиты
ВТОРИЧНЫЕ МИКРОБНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Общее число Из них без В том числе продуцируемых описанных антибиот. грибами актиноми- бактериями активности цетами 11500 6400 3700 1400 900 Наиболее активные продуценты относятся к родами Aspergillus – 950 соединений; Penicillium – 900 соединений; Fusarium – 350 соединений
В 1990 г из 16 млрд $, вырученных от продажи продуктов биотехнологии, 8 млрд $ составила стоимость пенициллинов и цефалоспоринов, т. е. продукция только двух родов грибов дала половину мирового биотехнологического рынка.
• Циклоспорин В 1983 г. разрешение на клиническое применение получил антигрибной антибиотик, продуцируемый Tolypocladium inflatum, клиническая ценность которого определялась его побочным эффектом – способностью вызывать иммуносупрессию, избирательно ингибируя высвобождение интерлейкина-2 из Т-4 лимфоцитов. • Ловастатин В 80 -е годы в клиническую практику был введен специфический ингибитор синтеза холестерина – ловастатин, который, вместе с его полусинтетическими аналогами широко используются в клинике. Открытие циклоспорина и ловастатина стимулировали поиск природных фармакологически активных соединений. Обнаружено, что многие древоразрушающие базидиомицеты (лакированный трутовик, сиитаке, вешенка и др. ) обладают комплексом полисахаридов, оказывающих общеукрепляющий, иммуномодулирующий и антираковый эффект.
Витамины – рибофлавин, каротиноиды (из мукоровых и сумчатых грибов) Полисахариды Хитин, пуллулан, склероглюкан. Используются для приготовления полимерных пленок, как иммуномодуляторы и антираковые препараты, адсорбенты, для заживления ран и ожогов. Трансформация стероидов с помощью мукоровых и курвуларии. Органические кислоты лимонная, глюконовая, итаконовая, яблочная и др. (из аспергиллов). Фитогормоны и регуляторы роста растений гиббереллин, фузикокцин, гетероауксин, абсцизовая кислота. Рассмотрим: Грибы в получении ферментов, в особенности гидролаз α-амилаза, пектиназы, целлюлазы, протеазы, лигнин-пероксидазы, целлюлазы и др. Грибы в пищевых, в бродильных производствах
• Рынок ферментов – 4, 2 млрд. долларов США (2008 г. ) из 49 млрд. в «белой» биотехнологии • Из 2500 известных ферментов немногие производятся в промышленных масштабах, из них 80% - гидролазы.
Объемы продаж ферментов микроорганизмов
Грибные ферменты биотехнологического назначения (из 6 классов согласно классификации по типам реакций) (Tracz, Lange, 2004) Фермент Организм Применение 1. Оксидоредуктазы 1. 1. 3. 4: Глюкозооксидаза Aspergillus niger Penicillium notatum Диагностика (медицина), пищевая пром. , хлебопечение 1. 10. 3. 2: Фенолоксидазы, лакказы 1. 1. 7: Пероксидаза Лигнин пероксидаза Марганец пероксидаза Pycnoporus cinnabarinus, ЭЦ Mycelioophora thermophila, ЭЦ Trametes versicolor, ЭЦ Li. P, Phanerochaete chrysosporium, ЭЦ Mn. P, P. chrysosporium, ЭЦ Деградация лигнина Органический синтез Деградация лигнина
Грибные ферменты биотехнологического назначения Фермент Организм 2. Трансферазы 4. Лиазы Полиметилгалактори назы и полигалакториназы в пектиназном комплексе 4. 2. 2. 2. 5. Изомеразы 6. Лигазы Бактерии A. niger, T. reesei, ЭЦ В основном из бактерий Применение Фруктовые и овощные соки
Грибные ферменты биотехнологического назначения Фермент 3. Гидролазы 3. 1. 1. 1: Липазы 3. 1. 1. 3: Карбоксилэстераза 3. 1. 3. 8: Фитаза Организм Применение Candida rugosa, ЭЦ Candida antarctica, ЭЦ Thermomyces lanuginosus Rhizomucor miehei, ЭЦ Органический синтез Детергент Пищевая пром. Orpinomyces sp. Aspergillus awamori Деградация ксилана Приготовление пшеничных отрубей Phy. A, Aspergillus niger, ЭЦ Phy. A, A. terreus, ЭЦ Phy. A, M. thermophila, ЭЦ Phy. A, T. lanuginosus, ЭЦ Phy. A, A. oryzae, ЭЦ Phy. A, Базидиомицеты (Agrocybe pediades, Trametes pubescens, Ceriporia sp. , Peniophora lycii) Добавка в корм
Грибные ферменты биотехнологического назначения Организм Применение Aspergillus oryzae, ЭЦ Rhizopus oryzae, ЭЦ A. awamori, ЭЦ Trichoderma reesei, ЭЦ Гидролиз крахмала, пищевая пром-ть Производство гкюкозофруктозного сиропа Пищевая пром. , стирка R. Oryzae Aspergillus kawachii Пивоварение Ферментация сошу 3. 2. 1. 21: β-глюкозидаза Trichoderma reesei, ЭЦ Деградация целлюлозы 3. 4. 21: Серин протеаза A. niger, A. oryzae Кожевенное производство, соевый соус 3. 4. 23: Аспартат протеаза, пепсин (реннет), химозин R. miehei, ЭЦ, Mucor pusillus, ЭЦ Производство сыра Фермент 3. Гидролазы 3. 2. 1. 1: α-Амилаза 3. 2. 1. 3: β-Амилаза 3. 2. 1. 3. Глюкоамилаза 3. 2. 1. 4: 1, 4 - βглюканэндогидролаза 3. 2. 1. 6: 1, 3(4)- βглюканэндогидролаза 3. 2. 1. 8: Ксиланаза
Поиск грибов – продуцентов ферментов для биотехнологического применения и медицины
Почему грибы перспективны в качестве продуцентов ферментов? 1. Высокое видовое и эколого-трофическое разнообразие грибов и широкий спектр ферментов активных в разных диапазонах р. Н, температуры и т. д. 2. Главное преимущество грибов (особенно у представителей аспергилов и триходерм) – способность секретировать огромное количество внеклеточных белков в среду. Мутантные штаммы T. reesei экскретируют до 40 г целлюлаз/л (Penttila, 1998). Продукция рекомбинантной фитазы аспергилов, экспрессированная в метилотрофных дрожжах Pichia angusta, достигает 13, 5 г/л (Mayer et al. , 1999). 3. Возможность культивирования на простых средах и высокая скорость роста. 4. Культуральную жидкость (КЖ) с ферментом можно легко отделить от мицелия. 5. Фильтрат КЖ часто обладает высокой ферментативной стабильностью. Амилоглюкозидаза A. niger при 0 -4 о. С сохраняет 100% активности в течение 1 года (Frost, Moss, 1987)
• Классический скрининг – базируется на биоразнообразии и представляет наиболее продуктивный подход к поиску новых ферментов, обеспечивает понимание новых ферментных процессов (Ogawa, Shimizu, 1999).
Поиск штаммов грибов – продуцентов требуемых ферментов включает ряд этапов: - анализ данных об известных микроорганизмах, синтезирующих необходимый нам фермент; определение систематической группы микромицетов, представители которой потенциально способны к образованию; выяснение эколого-трофической принадлежности и распространения этой группы грибов в различных компонентах экосистем (почвах, илах, на растениях и т. д. ); - поиск штаммов в коллекциях микроорганизмов; - отбор наиболее перспективных с точки зрения выделения образцов из природных и техногенных местообитаний; - с учетом физиолого-биохимических свойств потенциальных продуцентов разработка методов их изоляции в чистую культуру; - выбор известных или разработка новых приемов первичного скрининга продуцентов и отбор наиболее активных штаммов;
Среды и реагенты для выявления внеклеточных и связанных с клетками ферментов микроорганизмов Фермент Субстрат Реагент Критерий для отбора штаммов Амилаза Крахмал/гликоген Раствор иода Прозрачные ( -амилаза) или красные ( -амилаза) зоны на окрашенном фоне -Амилаза Крахмальный азур Бледно-синий ореол Целлюлоза Целлюлозный азур Бледно-синий ореол Фильтровальная бумага Разложение фильтровальной бумаги Аморфная или Зоны просветления микрокристалическая целлюлоза Хитиназа Хитин Прозрачные зоны в нерастворимом хитине Пектатлиаза Яблочный пектин или Гексадецилме Прозрачные зоны в полигалактуроновая тиламмоний осажденном субстрате кислота бромид Ксиланаза Ксилан Этанол Прозрачная зона в осажденном субстрате через 16 час. Пуллуланаз Пуллулан Этанол или Прозрачная зона в субстрате а ацетон через 16 час. Снятое молоко Зоны просветления Протеазы Желатин Насыщенный Зоны просветления в раствор осажденном субстрате сульфата аммония
Фермент Субстрат Липаза, эстераза Твин-60, 80 Оливковое масло Триолеин Лакказа, пероксизда за, тирозиназа Лакказа, пероксидаз а Тирозиназа Танин (0, 1%) или галловую кислоту добавляют в агарсолодовую среду α-нафтол (0, 005%) или гваякол (0, 005%) или бензидин (0, 1%) в уксусном буфере с р. Н 4, 4 добавляют в агарсолодовую среду Тирозин (0, 2%) в сусло-агаре Реагент Критерий для отбора штаммов Твин вводят в подходящую среду. Опалесцирующий ореол. Зоны просветления Коричневая обраска вблизи растущего мицелия Синяя окраска среды Красно-коричневая Синяя окраска Красно-коричневая окраска
Протеолитическая активность грибных изолятов Оценка активности изолятов гидролизовать белок по D-аланин концу белка. Рост с naphtyl-Ala После добавления Fast Blue RR
- вторичный скрининг, оптимизация условий культивирования для выявления максимальной ферментативной активности; - разработка или оптимизация приемов выделения фермента из культуральной жидкости и последующее изучение его свойств.
• Протеолитические ферменты - регуляторы концентрации белков, активаторы и ингибиторы ферментов и их предшественников, способны к проведению реакций ограниченного протеолиза. Играют ключевую роль в высоко специфичных процессах свертывания крови и лизисе фибриновых сгустков.
Классификация протеолитических ферментов • Пептидазы (Экзопептидазы) Карбоксипептидазы -C NАминопептидазы • Протеиназы (Эндопептидазы) ---
Семейства протеиназ Семейство Активный центр Ингибиторы Сериновые Ser-His-Asp Диизопропилфторфосфат, галоидметилкетоны Аспартильные Asp-Ser-Gly Нитраты феноксипропана, пепстатин Цистеиновые Cys-His Сульфгидрильные реагенты Металлопротеиназы Men+ (Zn 2+) Этилендиаминтетраацетат Новые семейства: Треониновые – открыты в 1995 г. у эукариот Глутаматные – открыты в 2004 г. у микромицетов Аспарагиновые – открыты в 2010 г. у вирусов, прокариот и низших эукариот
Типы действия протеиназ • Прямой лизис белкового субстрата (тотальный протеолиз) • Ограниченный протеолиз
Протеазы бактерий и грибов Бактерии Мицелиальные грибы • Синтез небольшого числа • Внеклеточные протеиназы – индивидуальных наиболее протеиназ (1 -3) распространенный тип секретируемых ферментов • Работают в нейтральных условиях (р. Н 5 -8) • Комплекс секретируемых протеиназ состоит из 5 -12 различных ферментов • Способность протеиназ работать в широком интервале р. Н (4 -11) и температуры
• Протеиназы мицелиальных грибов изучаются • есть перспектива использования в медицинской практике или биоиндустрии • выступают в качестве факторов патогенности возбудителей болезней • продуценты модельные объекты для изучения свойств и биологической роли ферментов.
Грибы – экстремофилы Выделен новый род аскомицетов Sodiomyces (вид Sodiomyces alkalinus), установлен алкалофильный тип адаптации (каф-ра микологии и альгологии МГУ, Е. Н. Биланенко с коллегами).
Динамика биомассы S. alkalinum при росте на сусле с разным уровнем р. Н
Сериновая протеиназа (необратимо ингибируется специфическим ингибитором субтилизино-подобных сериновых протеиназ – PMSF – в концентрации 10 -5 М), Оптимум р. Н =10 -11. Культуральная жидкость обладает щелочной целлюлазной активностью, лакказная и пероксидазная не обнаружена. S. alkalinus Активность, А 410, ед*100 Протеолитическая активность по субстрату GLP-AAL-p. Na p. H Протеолитическую активность определяли по белковым (азоказеин) и синтетическим пара-нитроанилидным субстратам - Glp-AAL-p. Na, Suc AAPL-p. Na.
Протеолитические ферменты грибов и их воздействие на систему гемостаза
• Накопление фибрина в кровеносных сосудах – причина тромбозов, которые могут привести к инфарктам миокарда и другим сердечнососудистым заболеваниям.
Взаимосвязь процессов свертывания крови и фибринолиза ФИБРИНОГЕН ПРОТРОМБИН (коаг) ФИБРИН (тромб) VIIIa Va ПРОТЕИН С акт Тканевые активаторы плазминогена ПРОТЕИН С ПЛАЗМИН (гидр) ПЛАЗМИНОГЕН Аминокислоты
• Одним из путей лечения и предотвращения сердечнососудистых заболеваний является поиск грибов-протеиназ с высокой фибринолитической и антикоагулянтной активностью и разработке препаратов. • Ищутся протеиназы, способные аналогично плазмину крови человека осуществлять прямой гидролиз фибрина, т. е. растворять тромбы крови в сосудах человека. • Перспективны протеиназы активаторного и антикоагулянтного действия, которые посредством ограниченного протеолиза протеина С запускают каскад реакций по приводят к активации процессов, предотвращающих тромбообразование и восстанавливают кровоток.
Какие грибы интересны в поиске протеиназ для регуляции гемостаза? • • Почвенные сапротрофы Фитопатогенные Энтомопатогенные Каких таксонов?
Корреляция между внеклеточной протеолитической активностью и таксономическим положением исследованных мицелиальных грибов Виды грибов, относящиеся к аскомицетам, в том числе, энтомопатогены, преимущественно секретировали сериновые пептидазы семейства субтилизина. Грибы, относящиеся к базидиомицетам, в основном, секретировали металлопротеиназы, и обладали низкой субтилизиноподобной активностью (Семенова, 2011)
Корреляция между внеклеточной протеолитической активностью и типом питания исследованных мицелиальных грибов белый Виды грибов – сапротрофов, в отличие от патогенов, не секретировали трипсиноподобных ферментов, и обладали более высокой относительной активностью аминопептидаз (Семенова, 2011).
Протеиназы микромицетов с фибринолитическими и профибринолитическими свойствами
Виды рода Aspergillus Число штаммов %, от числа изученных с тромболитической активностью с фибринолитической активностью A. awamori 4 0 0 A. candidus 8 37, 50 A. carneus 3 33, 30 66, 60 A. clavatus 3 0 33, 30 A. flavipes 12 41, 66 A. fumigatus 12 25, 00 58, 32 A. nidulans 2 50, 00 A. niger 9 0 11, 10 A. ochraceus 7 42, 90 A. oryzae 3 33, 30 A. terreus 6 66, 60 83, 20 A. ustus 5 0 60, 00 A. versicolor 7 14, 30 14, 40 A. wentii 5 20, 00 40, 00
Протеиназы микромицетов с фибринолитической и тромболитической активностями Источник тромболитических протеиназ p. Hopt Topt, o. C Препарат, полученный на основе протеиназы Aspergillus oryzae 6, 0 -7, 5 37 Аспергиллины О и М, CA-7 Aspergillus terricola 6, 5 -6, 8 37 Террилитин Aspergillus candida 2, 7 -3, 5 40 Е. 072. 534. Ф-43 Aspergillus ochraceus 7, 8 -8, 0 - Окраза, Браназа Penicillium janthinellum 3, 0 -4, 0 - Пептидаза А Penicillium chrysogenium 8, 0 37 - Fusarium oxysporum N. R. C. 1 6, 98 37 Протеиназы I и II Fusarium pallidoroseum 7, 0 40 - Fusarium sp. CPCC 480097 8, 5 45 Fu-P Trichothecium roseum 8, 0 -9, 0 37 Трихолизин (Триаза) Arthrobotrys longa 6, 0 -9, 0 37 Лонголитин
Сравнение фибринолитической и казеинолитической активностей различных препаратов Удельная активность Препарат Белок мг/мл Фибринолитическая усл. ед. /мг белка Казеинолитическая, мкг Tyr/ мг белка Фибринолизин 1, 3 2140 12, 6 Трихолизин 0, 4 3330 27, 9 Трипсин 3, 7 243 122, 0
Почвенный хищный гриб-нематофаг Arthrobotrys longa – продуцент Лонголитина
Препарат «Лонголитин» и его разработка • Ферментный комплекс ЛОНГОЛИТИН выделен из культуральной жидкости почвенного хищного гриба нематофага Arthrobotrys longa • Лонголитин обладает суммарным эффектом: фибринолитическим, тромболитическим, способностью активировать плазминоген (активаторная активность) и незначительным протеолитическим действием • Препарат находится на стадии доклинических испытаний • Планируется создать гелевую лекарственную форму для лечения тромбозов
Протеиназы микромицетов с коагулянтными свойствами
Способность к свертыванию плазмы крови мицелиальными грибами Микромицеты/род Число штаммов микромицетов обследованных Свертывающих плазму 1: 5 1: 2 Без разведения Aspergillus 22 9 8 7 Penicillium 52 31 - 9 Cladosporium 17 14 5 1 Alternaria 7 2 1 2 Fusarium 21 11 7 7 Cephalosporium 1 0 0 0 Acremonium 3 0 0 0 Verticillum 5 0 0 1
Субстратная специфичность и ингибиторный анализ коагулазной и фибринолитической протеиназ из Aspergillus ochraceus HP-19 Активности Препарат p. Hopt Topt, o. C Ингибирование Коагулазная, усл. ед/мг белка Фибринолитическая, мкг Tyr/ мг белка Исходный 15 596 50, 4 - - Коагулазы (металлопроте иназа) 68 838 4, 7 8, 0 -10, 0 37 ЭДТА 435 38, 8 8, 5 37 ФМСФ Фибринолитические протеиназы (сериновая протеиназа) -
Протеиназы микромицетов с антикоагулянтными свойствами. Активаторы протеина С плазмы крови
Микромицеты КА, мкг Tyr/мл/мин ФА, усл. ед/мл ПФА, усл. ед. /мл АА, АЧТВ сек *100% Aspergillus ochraceus 1 183 1630 0 854 Aspergillus terreus 28 31 2850 0 33 Aspergillus terreus 67 52 2990 0 19 Aspergillus ustus om 3 0 0 Paecylomyces lilacinus 202 576 0 480 Penicillium claviforme 2 109 916 714 618 Penicillium variable 35 0 0 0 46 Penicillium lilacinus 73 126 4790 200 45 Stachybotrys atra 4 19 0 0 333 Fusarium sp. 5 48 616 0 250 Fusarium sp. 17 36 2540 2005 216 Trichoderma sp. 52 119 5190 0 114 Alternaria sp. 10 54 3490 0 500 Chaetonium globosum 0 0 0 57
Обнаружение антикоагулянтной активности внеклеточных протеиназ микромицетов Н. С. Ландау, А. В. Кураков, О. М. Гуликова, Б. Батомункуева, С. М. Струкова, Н. С. Егоров // Микробиология, 1998, т. 67. № 2, с. 215 -220 «… Обнаружены продуценты антикоагулянтов, удлиняющих частичное тромбопластиновое время, что может быть обусловлено активацией системы протеина С…»
Активности внеклеточных протеиназ штаммов Aspergillus ochraceus в максимуме активаторной к протеину С активности Активности Штамм Активаторов Плазминопротеина С, подобная, Е/мл Тромбиноподобная, Е/мл Общая протеолитическая, мк. М Tyr/мл/мин A. ochraceus 121 77, 5 46, 3 47, 5 108, 6 A. ochraceus 154 69, 0 81, 4 62, 3 110, 5 A. ochraceus 247 77, 9 99, 8 84, 2 167, 2 A. ochraceus 513 N 76, 1 81, 4 82, 7 40, 2 A. ochraceus L-1 71, 9 125, 5 95, 2 149, 8 A. ochraceus MA-1 71, 0 40, 4 32, 3 37, 7 A. ochraceus MA-2 64, 4 44, 9 39, 3 95, 1 A. ochraceus X-1 72, 2 80, 6 72, 1 58, 8 A. ochraceus X-2 69, 6 74, 5 63, 5 87, 9 1 Е = 1 мк. М p. NA/мин· 10 -3
Активаторы протеина С плазмы крови из яда южно-американского щитомордника Agkistrodon contortrix
Сопоставление активаторной к протеину С активности комплексного препарата белков культуральной жидкости Aspergillus ochraceus и препаратов протеиназ из яда щитомордника* Активаторы протеина С Активаторная к протеину С активность, мк. М p. NA/мл/мин · 10 -3 Комплексный препарат белков культуральной жидкости Aspergillus ochraceus 89, 5 Препарат активаторов протеина С из яда щитомордника ( «Ренам» ) 49, 2 Препарат активаторов протеина С из яда щитомордника ( «Dade Behring» ) 50, 6 *С учетом одинакового количества белка в пробах
Патенты • • • Осмоловский А. А. , Кураков А. В. , Крейер В. Г. , Баранова Н. А. , Егоров Н. С. Штамм Aspergillus ochraceus Wilhelm продуцент протеиназы – активатора протеина С плазмы крови. Патент РФ № 2461614, приоритет от 09. 03. 2011. Опубл. Бюл. № 26, 20. 09. 2012. Кураков А. В. , Осмоловский А. А. , Крейер В. Г. , Баранова Н. А. , Егоров Н. С. Штамм Aspergillus ochraceus Wilhelm продуцент протеиназы – активатора протеина С плазмы крови. Патент РФ № 2461615, приоритет от 09. 03. 2011. Опубл. Бюл. № 26, 20. 09. 2012. Осмоловский А. А. , Кураков А. В. , Крейер В. Г. , Баранова Н. А. , Егоров Н. С. Штамм Aspergillus ochraceus Wilhelm продуцент протеиназы – активатора протеина С плазмы крови. Патент РФ № 2461616, приоритет от 09. 03. 2011. Опубл. Бюл. № 26, 20. 09. 2012. Кураков А. В. , Осмоловский А. А. , Крейер В. Г. , Баранова Н. А. , Егоров Н. С. Штамм Aspergillus ochraceus Wilhelm продуцент протеиназы – активатора протеина С плазмы крови. Патент РФ № 2460772, приоритет от 09. 03. 2011. Опубл. Бюл. № 25, 10. 09. 2012. Осмоловский А. А. , Кураков А. В. , Крейер В. Г. , Баранова Н. А. , Егоров Н. С. Способ получения протеиназы – активатора протеина С плазмы крови. Положительное решение на выдачу патента РФ по заявке от 09. 03. 2011 № 2011108672.
Рекомбинантная ДНК технология • Целевая ДНК из организма-донора экстрагируется, разрезается эндонуклеазой и встраивается в клонируемый вектор • Рекомбинантная конструкция переносится в клетку хозяина • Клетки хозяина, в которые не встроилась перенесенная конструкция, элиминируются селективным приемом • Клетки хозяина при необходимости подвергаются скринингу для идентификации желаемого клона
Тренды и разработки: ДНК рекомбинантные технологии • Эффективные системы для экспрессии генов: прогресс ожидается от применения новых хозяев для повышения секреции ферментов. • Гены лакказы из дереворазрушающих грибов (Trametes versicolor, T. sangunea) были экспрессированы в дрожжах S. cerevisiae и Pichia pastoris (Hosida et al. , 2001; Brown et al. , 2002). Фермент Хозяин Донор Целлюлаза Ксиланаза Протеаза Химозин A. oryzae Trichoderma reesei A. oryzae Aspergillus niger var. awamori Humicola sp. Trichoderma sp. Thermomyces sp. Rhizomucor sp. Телята
Свойства целлюлаз термофильных грибов, экспрессированных в новых грибных хозяевах Optimal Temp (◦C) Thermal stability 4. 6 7 60 NR 53. 7 4 5. 0 5 65 NR 54. 6 Aspergillus oryzae 5 6. 9 2 75 80% residual activity for 10 min at 75◦C 42. 6 7 Aspergillus oryzae 5 6. 4 3 55– 60 Stable for 10 min at 60◦C 47. 9 avi 2 6 Humicola insolens NR 5. 6 5 NR NR 51. 3 Melanocarpus albomyces cel 7 b 7 Trichoderma reesei 6– 8 4. 2 3 NR NR 50. 0 Talaromyces emersonii cel 3 a 3 Trichoderma reesei 4. 02 3. 6 71. 5 T 1/2: 62 min at 65◦C 90. 6 cbh 1 7 Saccharomyces cerevisiae 6 4. 3 7 70 stable for 60 min at 70◦C 37. 0 Fungus Gene Family Host cel 7 a 7 Trichoderma reesei Chaetomium thermophilum cel 7 a 7 Trichoderma reesei Humicola grisea egl 2 5 Humicola grisea var thermoidea eg 1 Humicola insolens Acremonium thermophilum Thermoascus aurantiacus Optima l p. H 5. 5 p. I Molecular mass (k. Da)
Гидролиз целюлозных субстратов • • • Продуценты рода Trichoderma обладают высокой секреторной способностью. Грибы рода Penicillium синтезируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава и эффективнее расщепляют целлюлозу и содержащее ее растительное сырье. При этом индивидуальные ферменты Penicillium обладают высокой каталитической активностью и операционной стабильностью. • Получен рекомбинантных штамм-продуцент комплекса карборгидраз P. verruculosum с экспрессией целевых гомологичных и гетерологичных генов, содержащую целевую кодирующую последовательность, функционально связанную с регуляторными элементами гена целлобиогидролазы I P. verruculosum, которые представляют собой промотор, сигнальный пептид и терминатор гена целлобиогидролазы I (Синицын и др. , 2010) • К известным мультикопийным продуцентам эндо-1, 4 -глюканаз относятся штаммы на основе Trichoderma longibrachiatum [Clarkson et al. , 1995, US Patent 5, 419, 778], Tr. reesei [Saloheimo et al. , 1994, WO Patent 94/28117] и Humicola insolens [Rasmussen et al. , 1991, Patent WO 91/17243]. Известны различные грибные мультикопийные продуценты ксиланаз – Aspergillus niger [van den Broek et al. , 1994, US Patent 5, 358, 864], Tr. reesei [Nevalainen et al. , 1994, US Patent 5, 298, 405], Thermoascus auranticus [Yu et al. , 1990, US Patent 4, 966, 850], H. insolens [Schulein et al. , 1997, US Patent 5, 610, 048].
Тренды и разработки • Новые грибные ферменты • Скрининг грибов, продуцирующих фитазы с улучшенными свойствами (повышенной термостабильностью и каталитической активностью). • Решение - использование генов, кодирующих фитазы у термофильных и термотолерантных грибов.
Тренды и будущие разработки • Экспрессия генов фитазы Aspergillus в трансгенных растениях: установлена экспрессия phy. A гена из A. niger в семенах сои, рапса, пшеницы, риса и показано улучшение питания свиней и кур Экспрессия секреции фермента в определенном органе - в корнях для мобилизации фосфора из почвы. У биоинженерных Arabidopsis в 20 раз повышалась секреция фитазы в коневой зоне и рост на органическом источнике фосфора (фитиновой кислоте)
Тренды и будущие разработки • Генные библиотеки: Клонирование интересующих генов без предварительного изолирования чистых культур микробов, а непосредственно из ДНК, выделенного из природного образца. Перспективен поиск генов термофильных грибов для получения биокатализаторов. Экспрессия нового гена пока часто неудачна, но есть позитивные результаты экспрессии изолированных грибных генов из природных образцов в Aspergillus oryzae (Dalboge, 1997). • Инжиниринг биомолекул: улучшение свойств фермента путем изменений конкретных локусов его молекулы (методы функциональной геномики и протеомики, рекомбинантных технологий и др. соврем. мол-ген. подходов). 6 локальных мутаций в глюкозоамилазе A. awamori позволили увеличить ее термостабильность без потери активности.
Благодарю за внимание
Screening Shuffled Libraries • Shuffle 26 different subtilisin genes • Transform chimeric molecules • Plate on agar containing milk proteins • Look for zones of clearing • Assay under various conditions in 96 well plates • Can be done with mutant variations of single gene, too • (e. g. peroxidase)
• Reducing proteolytic degradation. One of the major challenges in fungal biotechnology, especially for the production of pharmaceutical proteins, is that the recombinant protein is often degraded by proteases of the fungal host. Reducing protease activities can be achieved by combining different approaches. One involves selecting or screening for fungal host strains with low protease activity. This can be accomplished either by direct selection, using "suicide" selection substrates, or by mutagenesis and screening for reduced protease activity on indicator plates. Other approaches are identifying and inactivating genes for specific proteases, identifying and modifying wide-domain protease regulators, and optimizing medium composition and fermentation protocols. 4 The isolation of mutant strains that can produce higher levels of a specific heterologous protein with subsequent removal of the expression construct is another strategy used to produce host strains with reduced proteolytic activity. 5
Минерализация фосфорорганических соединений в почве • • • Фитин – соль инозитофосфорной кислоты, в почве закрепляется в форме солей Ca, Mg, Fe, Al. Под действием грибных и бактериальных фитаз от фитина отщепляется фосфорная кислота. Лецитин и другие фосфолипиды – расщепляются фосфолипазами - экзоферментами бактерий и грибов. Фосфорные эфиры сахаров гидролизуются фосфолипазами. Высвобождение фосфорной кислоты из РНК и ДНК происходит под действием нуклетидаз. Достаточно быстро протекает разрушение нуклеиновых кислот и фосфолипидов в почве, более медленно – комплексных соединений фитина и полифосфатов.
Классификация протеиназ микроорганизмов, воздействующих на белки системы гемостаза • По типу действия: Фибринолитические Профибринолитические Фибриногенолитические Коагулянтные Прокоагулянтные Антикоагулянтные • По специфичности: Плазминоподобные Тромбиноподобные Остальные (активаторы плазминогена, протромбина, гидролизующие фибриноген)
Скачать презентацию Грибы продуценты гидролитических ферментов экологические аспекты
1. Griby-biotekh-chast-bot-2.ppt