Грайфер Дмитрий Маратович БИОСИНТЕЗ БЕЛКА Рибосома

Грайфер Дмитрий Маратович БИОСИНТЕЗ БЕЛКА

Рибосома - сложнейшая молекулярная машина клетки, ее функция состоит в том, чтобы переводить (транслировать) генетическую информацию, скопированную с ДНК в качестве матричной РНК, в полипептидные цепи белков. Эта функция одинакова во всех организмах от бактерий до человека. ДНК м. РНК Полипептидная цепь рибосома DNA

м. РНК Общие черты строения: односпиральность, направление чтения и написания 5’-3’, НТП, сарт-кодон, кодирующая последовательность, 3’-НТП м. РНК прокариот: ШД-послед-ти расположены за 3 -10 нт перед стар-кодоном. Они богаты пуринами и частично комплементарны пиримидин-богатым 3'-концевым послед-тям р. РНК малых субчастиц

Полицистронными являются также геномные РНК некоторых вирусов (например, вируса гепатита С. Особенности м. РНК эукариот : 1. 2. 3. 4. Одноцистронные 2. Нет ШД-послед-тей. Кэп на 5’-конце. 4. Поли(А) – послед-ть на 3’-конце.

Структура кэпа

т. РНК – сходство у всех организмов Инициаторные т. РНК аминоацилируются только остатками Met и «работают» только на стадии инициации: остатки Met для встраивания в синтезируемую полипептидную цепь (кроме самого первого) переносит «обычная» метиониновая т. РНК. Отличительная особенность прокариотической инициаторной т. РНК состоит в том, что она формилируется по N-концевой аминогруппе остатка Met специальными ферментами.

Факторы трансляции - одно- или многосубъединичные белки, подразделяющиеся на факторы инициации (IF), факторы элонгации (EF) и факторы терминации (RF от англ. releasing factor – «фактор освобождения синтезированного полипептида из рибосомы» ). Внутри групп каждый фактор дополнительно обозначается цифрами или буквами, следующими после сокращения IF, EF или RF. Перед названиями соответствующих факторов эукариот ставят букву «е» (eukaryotic), например, e. IF 2.

Инициация – процесс, приводящий к образованию комплекса, в котором старт-кодон AUG находится в пептидильном (Р) – участке рибосомы. Принципиальные отличия инициации на рибосомах эукариот. 1. Инициаторная метиониновая т. РНК НЕ формилирована. 2. Отличия в устройстве м. РНК – кэп на 5’-конце, наличие поли(А)хвоста на 3’-хвосте, отсутствие последовательностей Шайна – Далгарно. 3. Значительно усложненный механизм инициации с участием намного большего числа факторов. 4. Зачем нужен настолько усложненный путь инициации у эукариот?

Схема инициации у прокариот

Схема инициации у эукариот IF 1 IF 3 IF 2 e. IF 4 F – кэп-связывающий комплекс факторов e. IF 4 E – кэп-узнающий белок e. IF 4 A – АТР-зависимая хеликаза e. IF 4 G замыкает PABP и e. IF 4 E

Пример регуляции трансляции на стадии инициации. Тотальная репрессия трансляции в результате фосфорилирования факторов инициации (в частности, e. IF 2) у эукариот. Активируется в стрессовых условиях (тепловой шок, голодание и т. д. ) Образуется прочный комплекс, где оказывается связанным весь e. IF 2 B клетки, поэтому замена GDP на GTP в комплексе с e. IF 2 не происходит. 40 S 60 S пептид

Цикл элонгации. e. EF 1 – EF-Tu e. EF 2 – EF-G Аналогичны по функции, но не работают в гетерологичных системах

2. Цикл элонгации полипептидной цепи.

Схема образования пептидной связи Р-участок А-участок

3. Терминация трансляции наступает, когда в аминоацильном (А)-участке оказывается один из 3 -х стоп кодонов – UGA, UAG или UAA. RF от англ. Releasing factor RF 1 -го класса: У эукариот - e. RF 1 У прокариот : RF 1 узнает кодоны UAA и UAG, а RF 2 – кодоны UAA и UGA. Функции RF 1 -го класса - запуск гидролиза сложноэфирной связи между пептидильным остатком и молекулой т. РНК в Pучастке рибосомы (освобождение синтезированного полипептида).

Молекулярная мимикрия – сходство структуры RF и т. РНК. Связываясь с рибосомой, RF одним своим фрагментом, напоминающим антикодоновую шпильку т. РНК, узнает стопкодон, а другой его фрагмент, похожий на акцепторный конец, оказывается в пептидилтрансферазном центре. Отсутствие гомологии между про- и эукариотическими факторами Факторы терминации 2 -го класса – активируемые рибосомой GTPазы. RF 3 e. RF 3

e. RF 1 >100 Å anticodon 76Å CCA-3’end т. РНК

Общая схема Субчастицы готовы к реинициации на этой же м. РНК или к инициации трансляции новой м. РНК.

Характерные особенности терминации у прокариот: 1) освобождение синтезированного полипептида происходит до гидролиза GTP и без участия RF 3; 2) гидролиз GTP необходим для диссоциации RF 3 с рибосомы; 3) посттерминационный комплекс рибосом, содержащий RF 1/RF 2, выступает в роли фактора, обменивающего GDP на GTP в комплексе с RF 3. 4) RF 3 не требуется для гидролиза пептидил-т. РНК; вообще клетка может существовать и без этого фактора.

У эукариот оба фактора терминации действуют кооперативно и скоодинированно: 1) e. RF 1 имеет высокое сродство к e. RF 3, и оба фактора, скорее всего, образуют комплекс перед тем, как попасть на рибосому; 2) гидролиз GTP фактором e. RF 3 необходим для быстрого и эффективного гидролиза пептидил-т. РНК фактором e. RF 1.

Гидролиз GTP приводит к изменению конформации терминационного комплекса таким образом, что универсальная для всех организмов последовательность GGQ фактора e. RF 1, отвечающая за индукцию гидролиза пептидил-т. РНК, оказывается в пептидилтрансферазном центре рибосомы.

Рециклинг - диссоциация м. РНК и деацилированной т. РНК и последующая диссоциация рибосом на субчастицы, которые затем снова участвуют в процессе трансляции. У прокариот есть специальный RRF, который, действуя совместно с EF-G, диссоциирует рибосому на субчастицы. м. РНК, которая может оставаться связанной с 30 S субчастицей, удаляется из нее фактором инициации IF 3.

У эукариот и архей специализированного фактора рециклинга нет. Диссоциация 80 S рибосом эукариот на субчастицы после завершения терминации трансляции просходит при участии факторов инициации e. IF 3 и e. IF 6; диссоциацию м. РНК с 40 S субчастицы вызывает фактор e. IF 3 j, а диссоциацию т. РНК – фактор e. IF 1. Недавно показано, что при [Mg 2+]>1 m. M диссоциацию 80 S на 40 S+60 S вызывает белок ABCE 1.

Исключения 1. Неканоническая инициация – IRES – элементы некоторых вирусных и клеточных м. РНК. 2. Прочтение стоп-кодонов как смысловых: селенопротеиновые м. РНК и вариантный генетический код в силиатах (инфузориях). Причины этого. Примеры – у Stilonichia Paramecium стоп кодон только UGA, а кодоны UAA и UAG кодируют глутамин.

Аминокислота селеноцистеин - биологическая форма селена. Ее кодирует триплет UGA, являющийся обычно стоп-кодоном. Специальный механизм, благодаря которому происходит включение селеноцистеина в растущий полипептид, использует специфический структурный район в 3‘-НТО м. РНК - SECIS (от англ. Selenocysteine Insertion Sequence) и белковые факторы (SBP 2, EFSec и др. ). SECIS может быть расположен на расстоянии нескольких сотен нуклеотидов от UGA-кодона. AAAAAAA 3' ? Sec-т. РНК Sec EFSec AUG 5' м. РНК AUG GUGUGA SE C IS SBP 2 stop

IRES-элемент РНК вируса гепатита С- IRES (Internal Ribosome Entry Site) – очень своеобразный высокоструктурированный элемент вирусной РНК перед старт-кодоном. Он отвечает за инициацию трансляции вирусной РНК «в обход» клеточных регуляторных механизмов 5’ 3’

Последовательность событий при инициации трансляции РНК вируса гепатита С. Бинарный комплекс Рибосома, готовая транслировать РНК вируса

Результаты, полученные с помощью IRES-производных В связывании IRES участвуют рибосомные белки но не р. РНК. S 3 a G 263, A 275 (IIId)

Участки связывания IRES и м. РНК на рибосоме Выход м. РНК Вход м. РНК S 3 a

Сравнительная характеристика рибосом про- и эукариот Рибосома: эукариоты – 80 S мол. масса 4 – 4. 5 м. Да, примерно в 1. 5 раза больше, чем 70 S рибосома прокариот Субчастицы: малая – 40 S (1. 4 м. Да) большая - 60 S (ок. 3 м. Да) Компоненты субчастиц: белки, р. РНК, полиамины (спермин, спермидин, путресцин) и ионы К+ и Мg 2+. Все рибосомы эукариот содержат одинаковый набор р. РНК и белков. Содержание и количественный состав полиаминов зависит от природы организма и типа ткани. Обратимая диссоциация рибосом на субчастицы.

Сравнительная характеристика рибосом про- и эукариот Рибосома высших Рибосома бактерий организмов 20 нм 24 нм 28 S р. РНК 3500 -5000 нт, 5. 8 S р. РНК, 5 S р. РНК, 47 белков 16 S р. РНК 1500 нт, 23 белка 18 S р. РНК 1800 нт, 33 белка 23 S р. РНК 3000 нт, 5 S р. РНК, 34 белка

Гомология между структурными элементами 70 S и 80 S рибосом Гомология между р. РНК прокариот и эукариот Степень гомологии первичных и вторичных структур 5. 8 S р. РНК – гомолог 5’-концевого района 23 S р. РНК Консервативный «кор» вторичной структуры р. РНК

Консервативные положения и сегменты экспансии во вторичной стуктуре р. РНК, изображенные на структуре 16 S E. coli. Большие кружки – положения, всегда присутствующие в универсальном коре вторичной структуры. Сегменты экспансии нумерованы и обведены прямоугольниками.

Гомологичные рибосомные белки: Невысокая степень гомологии аминокислотных последовательностей и большое сходство пространственных структур гомологичных белков в рибосомах про- эукариот. Высокая степень сходства последовательностей между гомологичными рибосомными белками эукариот.

Качественные различия между рибосомами про- и эукариот 1. Рибосомы эукариот невозможно собрать in vitro из набора рибосомных белков и р. РНК. 2. Рибосомы эукариот на сегодняшний день не удалось закристаллизовать для рентгеноструктурного анализа.

Грайфер Дмитрий Маратович БИОСИНТЕЗ БЕЛКА Рибосома —