Гр- палочки возбудители кишечных инфекций Профессор Г Н

Гр- палочки, возбудители кишечных инфекций Профессор Г. Н. Кременчуцкий Кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии dsma@dsma. dp. ua

Семействро Enterobacteriaceae • Мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами • Подвижны (кроме Shigella и энтероинвазивных E. coli) • Есть поверхностные полисахариды, капсула только у Klebsiella • Факультативные анаэробы

E. coli. Окраска по Граму Shigella spp. Окраска по Граму

Нетребовательны к питательным средам (рост на МПА), селективными средами служат: vсреда ЭНДО (дифференциация на лактозопозитивные - E. coli, комменсал ЖКТ; и лактозонегативные – возбудители кишечных инфекций) v. Среды Плоскирева, висмут-сульфит агар, сальмонелла-шигелла (SS-)агар содержат соли желчных кислот, подавляющих рост E. coli

E. coli ферментирует лактозу Среда предназначена для выделения бактерий родов Shigella и Salmonella и Shigella не способны ферментироват ь лактозу

Антигены энтеробактерий О-антиген – ЛПС наружной мембраны клеточной стенки, полисахаридная часть; термостабильный; по О-антигену разделяют на серогруппы Н-антиген – жгутиковый белок флагеллин, термолабильный, отвечает за деление на серотипы К-антиген – поверхностные полисахариды, термолабильны, как правило, мешают определению О-антигенной специфичности (О-инагглютинабельность)

Факторы патогенности энтеробактерий Адгезия – фимбрии (пили), поверхностные белкиадгезины - лиганд-рецепторное взаимодействие бактериальных адгезинов с рецепторами эпителиальных клеток; 1 й этап неспецифический, 2 й специфический Колонизация- интенсивное размножение с образованием биопленок. Эндотоксин– липид А в составе ЛПС, термостабилен, высвобождается при разрушении клеточной стенки Энтеротоксины – термолабильный (LT) – усиливает активность аденилатциклазы; термостабильный (ST) – активирует гуанилатциклазу Цитотоксины (шигаподобные токсины) – вызывают гибель эпителиоцитов

Основные характеристики эндотоксина v. Иммуногенность v. Стимуляция выработки физиологически активных веществ v. Пирогенность v. Активация комплемента по альтернативному пути v. Повреждение сосудов микроциркуляторного русла (ЦИКи) v. Нарушение в результате сосудистых повреждений функций почек, печени, сердца, легких, мозга, развитие эндотоксического шока

Физиологические эффекты эндотоксина

Типы взамиодействия энтеробактерий со слизистой кишечника. I тип (энтеротоксигенные E. coli, V. cholerae) • Неинвазивные, нецитотоксичные, высоко энтеротоксигенные. • Вызывают холеру и холероподобные заболевания. • Размножаются на поверхности эпителия тонкого кишечника, не вызывая его повреждения, без инвазии. Действие энтеротоксина ведет к нарушению водно-солевого баланса и обильной диарее «секреторного» типа.

II тип (энтеропатогенные E. coli) • Цитотоксичные, ограниченно инвазивные, иногда энтеротоксигенные. • Вызывают энтерит (коли-энтерит) • Размножаются на поверхности эпителия тонкого и толстого кишечника с разрушением микроворсинок, повреждением апикальной поверхности эпителия, развитием умеренного воспаления и эрозий. При продукции энтеротоксина возможна диарея «секреторного» типа.

A. Электроннная микрофотография энтеропатогенной Escherichia coli (EPEC) B. Начальная адгезия EPEC на поверхность эпителиальной клетки опосредует агрегацию бактерий, инициирует активацию таких ферментов в клетке хозяина, как фосфолипаза С, протеинкиназа, высвобождение внутреннего Ca 2+. Перестройка цитоскелета ведет к образованию «пьедестала» , на котором располагается патоген.

III тип (энтероинвазивные E. coli, Shigella) • Высоко инвазивные, цитотоксичные, проникают в эпителиоциты толстой кишки и размножаются в них. • Вызывают дизентерию и дизентероподобные заболевания • Размножение в эпителиоцитах сопровождается цитотоксическим действием. Разрушение эпителиоцитов сопровождается выраженным воспалением и изъязвлением слизистой. Возможна диарея «инвазивного» типа.

. IV тип инвазивные, цитотоксичные (Salmonella, Yersinia) • Инвазивные, цитотоксичные, проникают через эпителий тонкого и толстой кишечника в собственную пластинку, размножаются в макрофагах и вызывают генерализованную инфекцию. • Размножение в макрофагах приводит к развитию выраженного воспаления с преимущественным поражением лимфоидной ткани и вторичными дефектами энтероцитов. При продукции энтеротоксинов развивается диарея.

Возбудители брюшного тифа и паратифов Семейство Enterobacteriaceae Род Salmonella Большинство сероваров рода Salmonella относятся к виду S. enterica Возбудитель брюшного тифа Salmonella typhi (Salmonella enterica серовар Typhi). Возбудители паратифов серовары: Salmonella paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C

• Salmonella typhi (Salmonella enterica serovar Typhi) • Salmonella – грамотрицательные неспорообразующиеп алочки с закругленными концами, подвижны (перитрихи).

• Факультативные анаэробы • На среде Эндо – бесцветные лактозонегативные колонии • Селективные средысреда Плоскирева, сальмонелла-шигелла агар и др.

Антигенная структура. Классификация по Кауфману-Уайту • О-антиген – термостабильный ЛПС наружной мембраны; по его специфичности выделяют серогруппы • Н-антиген – термолабильный жгутиковый белок флагеллин, может существовать в двух фазах; по его специфичности выделяют серовары

Антигенная структура. Классификация по Кауфману-Уайту Идентифи Группа кация абсорбир ованной О антисыво роткой Наименование Сомати ческий (О) Антиген Жгутико вый (H) антиген Фаза 1 Жгутико вый (H) антиген Фаза 2 О 2 A S. paratyphi A 1, 2, 12 a - О 4 B S. paratyphi B 1, 4, 5, 12 b 1, 2 О 7 C 1 S. Paratyphi C 6, 7, Vi C 1, 5 О 9 D S. typhi S. enteritidis S. dublin S. panama 9, 12, Vi 1, 9, 12 d g, m g, p iv 1, 5

Факторы патогенности • Фимбрии и белки наружной мембраны – факторы адгезии; • Эндотоксин (ЛПС); • Антифагоцитарный фактор - Vi антиген

Патогенез брюшного тифа • После попадания в ЖКТ часть сальмонелл погибает в кислом содержимом желудка; часть попадает в тонкий кишечник • После адгезии сальмонелла захватывается Мклеткой и транспортируется в подслизистую в лимфоидные клетки (Пейеровы бляшки) • Благодаря антифагоцитарным факторам сальмонелла размножается в лимфоцитах и попадает в лимфоток, далее в кровоток; = Инкубационный период • В крови часть сальмонелл будет разрушена (факторы естественной резистентности) и высвободится эндотоксин = Начало заболевания

• Оставшиеся сальмонеллы проникают в органы ретикуло-эндотелиальной системы, где клеточный иммунный ответ приведет к развитию гранулем; • В печени сальмонеллы по желчным протокам достигают желчного пузыря, где активно размножаются ( могут сохраняться годами); • С порциями желчи сальмонеллы вновь попадают в тонкий кишечник, но взаимодействуют уже с сенсибилизированной слизистой; • Результатом станет гибель энтероцитов и изъязвление слизистой; • В течение примерно 3 недель язвы зарубцовываются, и наступает выздоровление; • Возможные осложнения – перфорация кишечника, кишечное кровотечение, метастатические абсцессы.

Сальмонеллы проникают через слизистый слой

Клинические симптомы инкубационный период – 7 -14 дней v. Постепенный подъем температуры до 40 °, гастроэнтерит, папулезнопятнистая сыпь, брадикардия, головная боль; v. Спутанное сознание; v. Гепатоспленомегалия v

Эпидемиология • Источник инфекции – больной или бактерионоситель • Путь передачи – фекально-оральный • Основную роль играет фекальное загрязнение источников водоснабжения • Случаи заболевания брюшным тифом наблюдаются в течение всего года, но пик заболеваемости приходится на конец весны - лето

Лабораторная диагностика Неделя заболевания Материал Метод исследования 1 -я неделя кровь Бактериологический (гемокультура) 2 -я неделя А) Испражнения, моча Бактериологический (копрокультура, уринокультура) Конец 2 -ой недели Б) сыворотка Серологические методы А) Испражнения, моча Б) сыворотка Бактериологический (копрокультура, уринокультура) Серологические методы 3 -я неделя

Бактериологический метод Предварительный этап. Посев 5 мл крови в желчный бульон. 1 этап: Пересев с жидкой среды на среды Эндо, Плоскирева и др. 2 этап: • Макро- и микроскопическое изучение колоний; • отбор подозрительной колонии в реакции агглютинации на стекле с адсорбированной поливалентной сальмонеллезной сывороткой(содержит антитела к О-антигенам 2, 4 и др. маркеры серогрупп); • пересев колоний, давших положительную реакцию, на среды Ресселя или Клиглера. .

Среда Клиглера

3 этап: Идентификация по совокупности свойств: 1) культуральных, 2) морфологических, 3) тинкториальных; 4) биохимических по результатам роста на дифференциальнодиагностических средах системы API-20 E; 4) серологическая (антигенная) идентификация в реакциях агглютинации на стекле: • с адсорбированной сальмонеллезной поливалентной О-сывороткой; • с адсорбированными сальмонеллезными монорецепторными О-сыворотками для определения серогруппы; • с адсорбированными сальмонеллезными Нсыворотками для определения серотипа; 5) Определение чувствительности к типовым сальмонеллезным фагам – фаготипирование; 6) Определение чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков

Серологические методы • Реакция Видаля (развернутая реакция агглютинации): ставится в 4 рядах пробирок с разведениями исследуемой сыворотки с 4 -мя диагностикумами: БТО (брюшнотифозный Одиагностикум), БТН (брюшнотифозный Н-диагностикум); ПТА, ПТВ (диагностикумы Salmonella paratyphi A, S. paratyphi B)

РНГА (определенные О- и Нантигены сорбированы на поверхности эритроцитов=эритроцитарные диагностикумы) – более чувствительный, быстрый и специфичный метод обнаружения антител. Диагностический титр – 1: 640 Первыми появляются антитела против О-антигена (О-антитела=Ig. M), они достаточно быстро исчезают, и на смену появляются антитела против Нантигена (Н-антитела=Ig. G), которые сохраняются после выздоровления и обеспечивают иммунитет. Обнаружение антител против Viантигена означает бактерионосительство РНГА

Лечение • Патогенетическое: v. Антибиотикотерапия (ампициллин, триметоприм, фторхинолоны, ципрофлоксацин) v. Лечебные фаги (сальмонеллезный бактериофаг) v. Препараты для коррекции микрофлоры кишечника

Специфическая профилактика брюшного тифа ВОЗ рекомендованы две вакцины: • Живая пероральная вакцина – содержит живые Salmonella typhi штамм Ty 21 a (сальмонеллы также доставляются в Пейеровы бляшки, но самоуничтожаются после 4 -5 деления) • Инактивированная брюшнотифозная химическая вакцина для в/мышечного введения (содержит О-антиген и Vi-антиген) Специфической профилактики паратифов нет.

Возбудители дизентерии Enterobacteriaceae Род Shigella Виды: Shigella dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, and S. sonnei Семейство

По О-антигену выделяют серогруппы и серотипы

Морфология Мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами, неподвижны

Шигеллы, расположенные внутриклеточно

• Факультативные анаэробы • На среде Эндо – бесцветные лактозонегативные колонии • Селективные среды- среда Плоскирева, сальмонеллашигелла агар и др.

• Биохимически малоактивны, расщепляют отдельные углеводы только до кислоты; чувствительны к дезинфектантам Антигены О-антиген - термостабильный, ЛПС наружной мембраны К-антиген – капсульный антиген= поверхностные полисахариды, термолабильный

Факторы патогенности • Фимбрии и белки наружной мембраны – факторы адгезии; • Фермены патогенности: гиалуронидаза, муциназа, нейраминидаза • Эндотоксин (ЛПС); • Шига и шигаподобные токсины • S. flexneri, S. boydii, и S. sonnei способны продуцировать LT-энтеротоксин

Шига- токсины v термолабильные токсины приводят к прекращению синтеза белка и гибели клетки vмогут взаимодействовать с рецепторами энтероцитов, макрофагов и нервных клеток vобладают цитотоксическим, нейротоксическим и энтеротоксическим эффектами v. Шига-токсин может вызывать гемолитический уремический синдром с развитием почечной недостаточности

• Информация о факторах патогенности хранится в гигантской плазмиде • Продукция LT- энтеротоксина находится под контролем Ent – плазмиды • R – плазмиды обеспечивают устойчивость к антибиотикам

Патогенез Shigella после адгезии на поверхности энтероцитов индуцирует эндоцитоз, лизирует мембрану эндосомы и выходит в цитоплазму; вызывает реорганизацию клеточного актина, формируя себе «хвост» , выполняющий роль пропеллера, обеспечивающего перемещение из клетки в клетку.

Эпидемиология • Возбудители дизентерии, особенно шигеллы Зонне, отличаются высокой выживаемостью во внешней среде. При благоприятных условиях шигеллы способны к размножению в пищевых продуктах (салатах, винегретах, вареном мясе, фарше, вареной рыбе, молоке и молочных продуктах, компотах и киселях), особенно шигеллы Зонне. • Источником инфекции при дизентерии являются больные острой и хронической формой, а также бактерионосители, лица с субклинической формой инфекции, (носительство в течение нескольких месяцев). • Дизентерия – антропоноз с фекально-оральным механизмом передачи

Клинические проявления шигеллезов • Инфекционная доза – 100 клеток • Инкубационный период 2 -3 дня • Опорный симптом – эритроциты в испражнениях • Выделяют следующие формы и варианты течения инфекции: v. Острая дизентерия: колитический и гастроэнтероколитический варианты. v. Хроническая дизентерия: рецидивирующая и непрерывная. v. Бактерионосительство шигелл: реконвалесцентное и транзиторное.

Лабораторная диагностика шигеллезов Клинический материал: испражнения, ректальный мазок. Методы: 1. Бактериологический (культуральный метод) – основной; 2. Серологический метод (латексагглютинация, ИФА, РСК, РНГА, развернутая реакция агглютинации – «дизентерийный Видаль» ELISA для определения Shiga токсинов в испражнениях

Бактериологический метод Проводят в кратчайшие сроки – «у постели больного» Предварительный этап. Посев в селенитовый бульон 1 этап: Посев клинического материала или пробы из селенитового бульона на среды Эндо, Плоскирева и др. 2 этап: Макро- и микроскопическое изучение колоний пересев лактозонегативных колоний на среды Ресселя или Клиглера. 3 этап: Идентификация по совокупности свойств: культуральных, морфологических, тинкториальных; биохимических по результатам роста на дифференциально-диагностических средах системы API-20 E; серологическая (антигенная) идентификация в реакциях агглютинации на стекле (с поливалентной дизентерийной сывороткой и с группоспецифическими сыворотками); определение чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом.

Лечение • Симтоматическое: пероральная (в тяжелых случаях внутривенная) регидратация • Патогенетическое: v Антибиотикотерапия (ампициллин, триметоприм, фторхинолоны, ципрофлоксацин) v Лечебные фаги (дизентерийный поливалентный бактериофаг) v Инактивированная дизентерийная вакцина (содержит взвесь убитых шигелл) для лечения хронических форм инфекции v Препараты для коррекции микрофлоры кишечника

Возбудители холеры Семейство: Vibrionaceae Род: Vibrio Вид: V. cholerae

V. cholerae. Окраска по Граму. Грамотрицательные прямые или изогнутые палочки с полярно расположенным жгутиком, аэробы (цитохромоксидаза положительна), хорошо окрашиваются анилиновыми красителями

V. cholerae. Electron microscopy.

V. cholerae on TCBS Agar V. cholerae на TCBS агаре образует желтые колонии, а V. parahaemolyticus - зеленые V. cholerae устойчивы к действию щелочи, убивающей большинство комменсалов ЖКТ, но чувствительны к действию кислот. Растет при температуре от 10 до 40 °С (оптимальная 37 °С) на щелочных средах (при р. Н от 7, 6 до 9, 2).

Биохимические свойства V. Cholerae обладает невысокой сахаролитической и высокой протеолитической активностью. Холерные вибрионы Эль-Тор в отличие от классических биотипов гемолизируют эритроциты барана.

• О –антиген (полисахаридная часть ЛПС), термостабильный; по его специфичности выделяют 139 серогрупп, большинство непатогенны; возбудителями холеры являются представители серогрупп О 1 (V. cholerae биовар cholerae и V. cholerae eltor) и О 139 (V. cholerae Bengal) О- антиген состоит А, В, С компонентов, по сочетанию которых выделяют серотипы Огава(А, В), Инаба (А, С), Гикошима (А, В, С) • Н –антиген – жгутиковый белок флагеллин, термолабильный, общий у всех возбудителей холеры • Капсульный антиген только у V. cholerae Bengal Протективными антигенами считаются: О-Ag, Н-Ag, белки наружной мембраны, капсульный антиген для серогруппы О 139

Факторы патогенности • Высокая подвижность • Адгезины и факторы колонизации, связанные с фимбриями • Муциназа (разрушает муцин и открывает доступ к рецептору – ганглиозиду Gm 1); нейраминидаза, протеазы, гемагглютинин • Эндотоксин, высвобождающийся при разрушении вибрионов (роль в патогенезе неясна, возможно, действует на ССС) • Главный фактор патогенности – холероген = термолабильный энтеротоксин, сходный по строению и биологическому действию с LTтоксином эшерихий.

Патогенез холеры После адгезии и колонизации слизистой тонкого кишечника возбудитель остается на поверхности клеток, не вызывая воспаления (I тип взаимодействия). Образование комплекса токсина с ганглиозидом GM 1 запускает эндоцитоз. Дальнейшие события полностью определяются действием холерогена.

Потеря воды и электролитов приводит к обезвоживанию организма: • Падает артериальное давление • Нарушается микроциркуляция • Развивается гипоксия тканей • Метаболический ацидоз • Гипокалиемия • Острая почечная недостаточность • Сердечная недостаточность • Возможен гиповолемический шок

Лечение холеры • Симптоматическое – восстановление водноэлектролитного баланса: использование сухих регидратационных смесей или внутривенные вливания в тяжелых случаях. Состав смесей: Na. Cl, KCl, Na. HCO 3, глюкоза (для использования симпорта – канала совместного входа в клетку глюкозы и натрия, т. к. основной канал блокирован холерогеном) • Патогенетическое – антибиотикотерапия (тетрациклины)

Эпидемиология • V. Cholerae – нормальный обитатель пресных и соленых водоемов, может находиться в воде или в организмах простейших и др. обитателей.

Эпидемиология(продолжение) v Источник инфекции – больной или носитель v Резервуар – водный v Путь передачи – фекально-оральный v Холера – особо опасная инфекция в связи со способностью вызывать эпидемии и пандемии v Эндемичные районы – Индия, Юго-Восточная Азия v С 1817 г. Отмечены 7 пандемий: 6 из них вызывались классическим V. Cholerae, 7 -я - El Tor v В 1993 г. холера в Бенгале была вызвана вариантом O 139 – отдельные исследователи считают это началом 8 -ой пандемии

Лабораторная диагностика Клинический материал: испражнения, ректальные мазки и др. Методы: 1. Бактериологический –основной метод диагностики; 2. Серологические методы (опеделение антител против холерогена, агглютининов, вибриоцидных в сыворотке в реакциях агглютинации, бактериолиза, ИФА, РНГА ит. д. ); 3. Молекулярно-генетический метод (ПЦР для определения генов, кодирующих факторы патогенности); 4. Ускоренные методы диагностики (прямой иммунофлуоресцентный метод, метод иммобилизации вибрионов О 1 или О 139 -сывороткой при микроскопии в темном поле зрения, реакция микроагглютинации с холерной агглютинирующей О-сывороткой).

Бактериологический метод Предварительный этап: Накопление возбудителя в щелочной пептонной воде (при отсутствии видимогороста предварительная реакция агглютинации на стекле с О 1 -сывороткой) 1 этап: Посев материала с жидкой среды на плотную питательную щелочную среду (тиосульфа-цитрат-сахарозный агар с солями желчных кислот -TCBS) для получения изолированных колоний. 2 этап: Макро- и микроскопическое описание колоний; постановка реакции агглютинации на стекле со специфическойхолерной О 1 сывороткой; пересев типичных колоний на среды Ресселя или Клиглера для получения чистой культуры. 3 этап: Идентификация по совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных; биохимических свойств(по результатам роста на дифференцально-диагностических средах системы API-20 E; или по триаде Хейберга: вибрионы О 1 группы ферментируют сахарозу и маннозу, но не ферментируют арабинозу) ; антигенных (серологическая идентификация в реакциях агглютинации на стекле с поливалентной холерной О 1 сывороткой и адсорбированными типоспецифическими Огава и Инаба сыворотками); чувствительности к типоспецифическим холерным фагам и антибиотикам.

Профилактика холеры v Специфическая: вакцинация по эпидемическим показаниям -вакцина холерная бивалентная химическая таблетированная – содержит холерогенанатоксин и О-антиген сероваров Инаба и Огава -вакцина холерная (холероген-анатоксин + Оантиген) жидкая v Неспецифическая: повышенные санитарногигиенические требования; употребление кислых продуктов (лимоны, уксус и т. д. )