ГОУ ВПО «Сургутский государственный университет Ханты Мансийского автономного

ГОУ ВПО «Сургутский государственный университет Ханты Мансийского автономного округа» Кафедра микробиологии Куяров Александр Васильевич д. м. н. , профессор ЛЕКЦИЯ Анаэробные бактерии - возбудители гнойно-воспалительных и раневых инфекций (спорообразующие и неспорообразующие) 1

КЛОСТРИДИИ • • Всех анаэробов объединяет получение энергии путем субстратного фосфорилирования. • • По отношению к О 2 их подразделяй на три группы: а) строгие (облигатные) анаэробы, не переносят О 2, б) умеренно строгие анаэробы - выживают, но не размножаются в присутствии О 2, в) аэротолерантные - размножаются как в отсутствие так и в присутствии О 2. • • Анаэробы относятся к различным таксонам. В патологии человека наиболее существенное значение имеют: спорообразующие грамположительные бактерии рода Сlostrididium: возбудители анаэробной раневой инфекции: С. perfringens, С. novyi, С. histolyticum и др. , С. tetani - возбудитель столбняка. С. botulinum - возбудитель ботулизма; неспорообразующие грамотрицательные анаэробные бактерии родов Bacteroides, Fusobacterium и др. ; грамположительные неспорообразующие анаэробные кокки родов Peptococcus, Peptostreptococcus и др. ; анаэробные грамотрицательные кокки рода Veilonella. КЛОСТРИДИИ РАНЕВОЙ АНАЭРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ (ГАЗОВОЙ ГАНГРЕНЫ) Уильям Уэлч и Г. Наттелл американские патологи открыли С. perfringens типа А (1983) Чистую культуру получили французские бактериологи Адриен Вейон и Ж. Жубёр (1893), давшие ему название perfringens [от лат perfringo, проламываться]. 2

Морфология и физиология • • С. perfringens - крупные, утолщенные грамположительные спорообразующие палочки. Многие штаммы подвижны, in vivo образуют капсулу. На кровяном агаре окружены зоной гемолиза. На желточном агаре - зоной помутнения, что свидетельствует о наличии фермента лецитиназы. В столбике агара колонии имеют вид чечевичных зерен. Ферментируют с газообразованием углеводы. Протеолитические свойства выражены слабей. 3

• • • Рост Clostridium perfringens на среде Китта-Тароцци, проявляющийся помутнением среды и образованием пузырьков газа. В среду внесены кусочки печени для поглощения кислорода. «Штормовая реакция» . Clostridium perfringens интенсивно сворачивают молоко с образованием крупноячеистого губчатого сгустка уже через 3 ч. Прибор для культивирования анаэробов - Газ Пак Рост C. perfringens на сахарном агаре при посеве по Перетцу. Бактерии образуют чечевицеобразные колонии в толще среды и вызывают её разрывы за счёт газообразования. 4

• • • С. novyi - подвижные бескапсульные перитрихи. Эритроциты не гемолизируют. Ферментируют с газообразением ряд сахаров. В отличие от предыдущих видов разжижают желатину, образуют сероводород и аммиак. С. histolyticum – перитрихи, факультативные анаэробы. Не ферментируют углеводы, но обладают протеолитической активностью с образованием H 2 S. Антигены. C. perfringens различаются по антигенной специфичности секретируемых мембранотоксинов, что позволило разделить их на шесть сероваров: А, В, С и т. д. Среди С. novyi выделяют три серовара (А, В, С). Выделение данных сероваров не нашло практического применения. Патогенность и патогенез. В основе патогенного действия всех возбудителей анаэробной раневой инфекции лежит высокая скорость размножения и способность продуцировать токсины – альфатоксин и др. • • Альфа-токсин относится к типу мембранотоксинов. Ввызывает гидролиз фосфолипидов, входящих в состав клеточных мембран. Вследствие наступает гемолиз эритроцитов, распад тучных клеток, изменение мелких сосудов. При действии на мембраны лейкоцитов снижается фагоцитарная активность последних. Тета-токсин оказывает прямое и опосредованное действие на клетки «мишени» . Прямое - заключается в разрушении эритроцитов, лейкоцитов эндотелиальных клеток, в обеспечении инвазии и участии в некрозе в очаге инфекции. Опосредованное - состоит в воздействии на клетки миокарда и нарушении сердечной деятельности, усилении выхода лейкоцитов и эндотелиальных клеток в ткани, стимуляции выхода противовоспалительных цитокинов (может привести к шоку). Для патогенных клостридий характерно образование ферментов, вызывающих деструкцию тканей: гиалуронидаза, 5 коллагеназа, ДНК-аза.

• • Все это приводит к гангренозному, экссудативному или флегмонозному воспалению подкожной клетчатки, особенно мышц которое сопровождается накоплением большого количества газа и экссудата. Всасывание микробных токсинов наряду с токсическими продуктами распада мышечной ткани, вызывает токсинемию. В тяжелых случаях возможно развитие сепсиса. Существенное значение в патогенезе имеет вторичная микрофлора: непатогенные клостридий, стафилококки и другие бактерии. C. perfringens может продуцировать энтеротоксин, вызывающий диффузный понос. Серовар А С. novi продуцирует альфатоксин С. septicum - мембранотоксин. • • • Иммунитет. В процессе инфекции образуются антитоксины, что приводит к формированию антитоксического иммунитета. Он определяется уровнем антитоксина и противоферментативных антител в сыворотке крови. Однако напряженность постинфекционного иммунитета невысока. Противомикробные антитела не обладают протективными свойствами, чтобы препятствовать размножению клостридий. Экология и эпидемиология. Средой обитания для клостридий является кишечник животных, особенно травоядных и свиней, для С. perfringens - и кишечник человека. С фекалиями клостридий попадают в почву, в которой при благоприятных условиях могут размножаться. В почве клостридий сохраняются в виде спор в течение длительных сроков. Инфекция передается при попадании возбудителя с почвой или инфицированным материалом на 6 раневую поверхность.

• • Входными воротами инфекции являются раны. Благоприятные условия для размножения анаэробов создаются при осколочных рваных ранах. Анаэробная инфекция в мирное время встречается редко, главным образом, как осложнение открытой травмы, послеоперационных ран и криминальных абортов. Необрабатываемые почвы (скалистые, песчаные) в отличие от плодородных культивируемых почв, не являются источником анаэробной инфекции. Лабораторная диагностика. Материал для исследования: кусочки пораженной ткани. Для бактериоскопического исследования используют иммунофлюоресцентный метод. Бактериологическое исследование проводят путем выделения чистой культуры на кровяном агаре, среде Вильсон. Блера. Используют биопробы для выявления токсина в исследуемом материале. • • • Экспресс-метод - применяют газожидкостную хроматографию для определения клостридий в раневом отделяемом. Серодиагностика не применяется. Профилактика и лечение. Вакцинопрофилактика не проводится. Для пассивной профилактики, так же как и для терапии, применяют антитоксическую поливалентную сыворотку или иммуноглобулин, полученный из этой сыворотки, который вводят внутримышечно в возможно более короткие сроки после ранения. В случае идентификации возбудителя показано введение антитоксической сыворотки против токсинов клостридий данного вида. Для этиотропного лечения применяют антибиотики (бета-лактамы, аминогликозиды), которые эффективны против клостридий и возбудителей вторичной инфекции. Анатоксин не получил применения для профилактики (низкая 7 иммуногенность).

Схема бактериологического исследования Clostridium perfringens 8

Клостридии столбняка Возбудитель столбняка С. tetani впервые обнаружен А. Николайером в 1884 г. и выделен в чистой культуре С. Китазато в 1889 г. • • Морфология и физиология. Клетки С. tetani - крупные прямые, перитрихи, капсулу не образуют. Споры круглые, больше диаметра клетки, расположены терминально. Углеводы не ферментируют, не образуют индола, восстанавливют нитраты, медленно свертывают молоко. Культивируются на среде Китта. Тароцци, сахарном кровяном агаре. Колонии окружены зоной гемолиза. Хемоорганотрофы. С. tetani не образуют каталазу и оксидазу, ферментируют глюкозу, лактозу и другие сахара, не образуют индола, восстанавливают нитраты, разжижают желатину. • • Антигены. Содержат видоспецифический О-антиген и типоспецифические Н-антигены, по которым выделяют около 10 сероваров. Антигенная специфичность столбнячного экзотоксина стабильна. Патогенность и патогенез. Патогенность С. tetani определяется секрецией сильнодействующих двух белковых токсинов. Тетаноспазмин представляет собой белок, непрочно связанный с клеткой. В питательной среде появляется в результате их аутолиза. Тетаноспазмин - функциональный блокатор, способный соединяться с рецепторами нейронов. Его токсичность объясняется прямым влиянием на процесс передачи нервных импульсов в головном и спинном мозге. 9

• • Тетанлизин - секретируемый белок, антигенно сходный с О-стрептолизииом и тета-токсином С. perfringens. Он относится к мембранотоксинам, вызывает гемолиз эритроцитов. Заболевание начинается после прорастания в ране спор возбудителя и продуцирования вегетативными клетками токсинов, которые гематогенным путем разносятся по организму. У человека столбняк протекает по нисходящему типу. Независимо от места проникновения возбудителя в организм первыми симптомами являются тонические сокращения жевательных и мимических мышц, затем тоническое сокращение и спазм мышц затылка и спины. Тело принимает вид дуги. Смерть наступает от асфиксии и поражения жизненно важных нервных центров. Столбняк может наступить после родов, у новорожденных и после операций. У новорожденных столбняк возникает вследствие плохой обработки антисептиками пупочного канатика, у рожениц - при попадании спор через слизистую оболочку матки • • • Иммунитет. После перенесения столбняка иммунитет отсутствует, хотя тетаноспазмин обладает выраженной иммуногенной активностью. Это связано с недостаточным его количеством вследствие быстрого проникновения в нейроны. Возможны повторные заболевания. Экология и эпидемиология. Возбудитель столбняка широко распространен в природе. Средой обитания является кишечник животных и человека. С фекалиями он попадает в почву, в которой образуются споры, сохраняющиеся много лет. Заражение наступает только при проникновении спор в организм через раневую поверхность, особенно при создании в них анаэробных условий. Лабораторная диагностика. У больных практически не проводится вследствие выраженности клинической картины. Бактериологическое исследование на наличие возбудителя и его спор осуществляется для проверки стерильности перевязочного материала 10 и препаратов, предназначенных для парэнтерального введения.

• • Профилактика и лечение. • Вакцинопрофилактика столбняка проводится путем иммунизации взрослых и детей препаратами, в которые входит столбнячный анатоксин (АКДС, АДС адсорбированная коклюшная вакцина и дифтерийно-столбнячные • анатоксины). Для лечения применяется антитоксическая сыворотка и противостолбнячный • иммуноглобулин. Ботулизм • • • Ботулизм (синонимы: ихтиизм, аллантиизм) острая инфекционная болезнь, обусловленная поражением токсинами бактерий ботулизма нервной системы, характеризующаяся • парезами и параличами поперечнополосатой и гладкой мускулатуры, иногда в сочетании с синдромом гастроэнтерита в начальном периоде. • С. botulinum - возбудитель ботулизма, впервые открыл Э. Ван Эрменгемом в 1896 г. Морфология и физиология. Бактерии разного размера с перитрихиально расположенными жгутиками. Образует споры, которые дают бактериальной клетке вид теннисной ракетки. Выраженной капсулы не имеют. Размножаются на глюкозокровяном агаре, образуя небольшие прозрачные колонии с ровными или изрезанными краями, окруженные зоной гемолиза. На жидких средах наблюдается равномерное помутнение и осадок. Сахаролитические свойства непостоянны и не используются для идентификации этих бактерий. По протеолитическим свойствам не однородны. Протеолитические штаммы гидролизуют казеин и образуют H 2 S. Антигены. Вид С. botulinum неоднороден по антигенной специфичности токсинов. Последние подразделяются на 7 сероваров: А, В, С и т. д. Изучение антигенной структуры бактериальных клеток в связи с особенностями патогенеза ботулизма при идентификации возбудителя не проводится. 11

• • Патогенность и патогенез. Патогенность клостридии ботулизма связана с его токсином, являющимся самым сильным ядом, 1 мкг которого может убить взрослого человека. Экзотоксин является нейротоксином. • Состоит из двух субъединиц, одна из которых отвечает за адсорбцию на рецепторах чувствительных клеток нейронов, другая - за проникновение в них путем эндоцитоза и развитие последующих событий. В ингибиции Са-зависимого • освобождения ацетилхолина, вследствие чего блокируется передача нервного импульса через синапсы. Это приводит к поражению • бульбарных нервных центров, нарушению походки, зрения, асфиксии и другим явлениям. Летальные исходы до 60%. Образование ботулотоксина контролируется профагом при • лизогенизации данных бактерий и генами C. botulinum. При попадании клостридии в рану может возникнуть ботулизм ран. При этом вегетативные клетки продуцируют нейротоксин, вызывая картину пищевой интоксикации. У детей 3 -8 мес. жизни ботулизм возникает в результате проникновения клостридии при родах через пупочный канатик. Болезнь протекает вяло вследствие поступления в организм малого количества токсина. Является причиной внезапной детской смертности. Иммунитет. Постинфекционный иммунитет отсутствует. Это связано со слабыми иммуногенными свойствами ботулинистического экзотоксина. Экология и эпидемиология. Естественной средой обитания С. botulinum является кишечник многих травоядных животных, а также рыб, ракообразных, моллюсков, в котором они размножаются и выделяются с фекалиями в окружающую среду. Споры клостридии ботулизма в значительном количестве встречаются в почве, воде, иле. 12

• • • Они резистентны к высокой температуре, и выдерживают кипячение в течение 1 -5 ч. Заражение происходит алиментарным путем. Причиной отравления является употребление рыбных, овощных, мясных консервов и других пищевых продуктов, в частности консервированных в домашних условиях. Лабораторная диагностика. Проводится одновременное выделение возбудителя и определение наличия токсина в исследуемом материале. Обязательно определяют серовар токсина. Для обнаружения токсина проводят биопробы путем внутривенного заражения белых мышей. Для обнаружения клостридии материал засевается на жидкие питательные среды в несколько флаконов, часть из которых прогревают для уничтожения посторонней микрофлоры. • Профилактика и лечение. Вакцинопрофилактика не проводится. • Для лечения используют противоботулиническую поливалентную сыворотку, поскольку антитела к одному серовару токсина не нейтрализуют другие серовары. Эту сыворотку вводят и с целью поздней профилактики лицам, подозреваемым в употреблении зараженных продуктов. 13

ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ, НЕ ОБРАЗУЮЩИЕ СПОР • Наиболее важное значение в инфекционной патологии человека имеют роды Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium, Porphyromonas. • • • Бактероиды • • Род Bacteroides из них В. fragilis, В. ureolyticum, В. thetaiotaomieron, B. melaninogenicus чаще других вызывают заболевания у человека. Морфология и физиология. Палочковидные клетки различных размеров. Как правило, неподвижные. Умеренно строгие анаэробы, хемоорганотрофы, метаболизируют углеводы, пептон или промежуточные продукты метаболизма. Размножение стимулируется гемином и витамином К. Не образуют пигменты. Антигены бактероидов отличаются вариабельностью и практически не используются для их идентификации и дифференцировки. • • • Патогенность и патогенез. Бактероиды принадлежат к условно патогенным бактериям. У иммунодефицитных лиц участвуют в возникновении гнойно воспалительных процессов в ассоциациях с аэробными бактериями. Факторами вирулентности являются капсулы, пили, белки наружной мембраны, которые участвуют в адгезии. Капсульный полисахарид как фактор агрессии защищает бактерии от фагоцитоза. Продуцируют ряд ферментов: нейраминидазу, фибринолизин, гепариназу, участвующие в инвазии, продукты метаболизма жирные кислоты с короткой цепью, биогенные амины, нарушающие функциональную активность макрофагов и лейкоцитов. ЛПС участвует в подавлении активности фагоцитирующих клеток. Встречаются при перитонитах, абсцессах брюшной полости, легких и гнойно воспалительных процессах другой локализации. 14

• Экология. Бактероиды являются обитателями толстой кишки человека. • • Лабораторная диагностика. Бактериологическое исследование с целью выделения чистой культуры и ее последующей идентификацией. • • Профилактика и лечение. Для лечения используют антибиотики широкого спектра действия. Фузобактерии • • • Род Fusobacterium для медицинской микробиологии наибольший интерес представляют F. nucleatum и F. necroforum. Морфология и физиология. Фузобактерии полиморфные, чаще веретенообразные, грамотрицательные палочки. Облигатные анаэробы. Спор и капсул не образуют, жгутиков не имеют. Хемоорганотрофы, обладают сахаролитическими свойствами, протеолитическая активность слабо выражена. Главный продукт ферментации масляная кислота, образуется в большом количестве. • • • Патогенность и патогенез. Фузобактерии проникают в организм через слизистую оболочку полости рта. В месте проникновения образуется язва. Выделяющаяся в больших количествах масляная кислота подавляет фагоцитоз. При разрушении фузобактерии освобождается эндотоксин (ЛПС). F. necroforum продуцирует экзотоксин, вызывающий гемолиз и повреждающий лейкоциты (относится к мембранотоксинам). В сочетании со спирохетой вызывает ангину Венсана, характеризующуюся некротическим поражением миндалин. Экология. Фузобактерии встречаются в десневой борозде полости рта, кишечнике и половых путях. Выделены из крови и гнойных очагов различных органов, а также из трофических язв. • Лабораторная диагностика с помощью бактериологического исследования. Трудности при идентификации фузобактерии и от бактероидов. • Лечение. Для лечения используют 15 фосфомицин, к которому фузобактерии очень чувствительны.

Превотеллы Анаэробные грамотрицательные кокки • К роду Prevotella относятся виды P. melaninogenicus и P. intemedius. • • Морфология и физиология. Полиморфные неподвижные неспорообразующие палочки. Образуют капсулу и пили. Обладают умеренными сахаролитическими свойствами. P. melaninogenicus образуют пигменты черного или темно коричневого цвета. • • • Патогенез. Факторы вирулентности те же, что и бактероидов. Продуцируют протеазу, разрушающую Ig. A, и образуют очень токсичный ЛПС, который может вызвать септический шок. Встречаются при абсцессах легких, плевритах и периодонтитах. • Экология. Экологическая ниша полость рта и верхние отделы респираторного тракта. • Лечение. Используют современные пенициллины. • • К ним относится несколько родов, в том числе род Veillonella, включающий семь видов. От людей выделены V. atipica, V. dispar, V. parvula. Остальные виды выделены только от животных (хомяки, крысы, морские свинки и др. ). Морфологически представляют собой грамотрицательные диплококки или короткие цепочки. Культивируют на молочном агаре, на котором они образуют блестящие колонии. Метаболизм бродильного типа. Сбраживают лактат, пируват, фумарат. Не сбраживают углеводы. Для размножения нуждаются в СО 2. Средой обитания является полость рта, кишечник и дыхательные пути человека и животных. Вейллонеллы выделены от людей с абсцессами мягких тканей, раневыми инфекциями, синуситами, отитами как в ассоциации с другими бактериями, так и в чистых культурах. Чувствительны к антибиотикам широкого 16 спектра действия.

ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ НЕСП 0 Р 00 БРАЗУЮЩИЕ АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ И КОККИ • • К ним относятся ряд родов, не включенных ни в какие семейства, которые встречаются при гнойно воспалительных процессах различной локализации в ассоциациях с другими бактериями (стафилококки, стрептококки, синегнойная палочка, протей, кишечная палочка). Это Propionibacterium, Eubacterium, Falcivibrio, Bifidobacterium. Содержат многочисленные виды, которые весьма сложно дифференцировать. Из кокков в данную группу включены роды Peptococcus и Peptostreptococcus. Их можно отнести к условно патогенным микроорганизмам, их роль как самостоятельных возбудителей инфекционных заболеваний не доказана. Появляются данные, свидетельствующие об их значении в патологии человека. Полиморфные неспорообразующие грамположительные некислотоустойчивые палочки. Подвижность вариабельный признак. Являются хемоорганотрофами с метаболизмом бродильного типа. Факультативные анаэробы. Пропионибактерии и эубактерии являются обитателями кожи и кишечника здоровых людей. Были выделены при абсцессах мягких тканей, подчелюстных абсцессах, раневой инфекции и даже сепсисе. • • Falcivibrio vaginalis встречаются при вагинитах и других гнойно воспалительных процессах. Бифидобактерии являются непатогенными. Их часто используют для приготовления молочно кислых продуктов. Обнаруживаются в полости рта и кишечнике, сточных водах. Были выделены при некоторых инфекционных процессах у человека. Пептококки принадлежат к роду Peptococcus, к которому относятся несколько видов. Представляют собой сферические бактерии, располагающиеся поодиночке, парами или в виде скоплений. Грамположительны, жгутиков не имеют, спор не образуют. Куль тивируют на 17 кровяных средах в анаэробных условиях.

• • Хемоорганотрофы с низкой сахаролитической активностью. Пептококки обнаруживаются в полости рта, носоглотки, женских половых органах, иногда на коже и в кишечнике здоровых людей. Их выделяют при различных воспалительных процессах: аппендиците, цистите, плеврите, послеродовой септицемии и других, обычно в ассоциациях с другими бактериями. Были обнаружены в чистой культуре, что подтверждает их этиологическую роль в патологических процессах. Пептококки чувствительны к пенициллину, карбенициллину, аминогликозидам и другим антибиотикам. • • Не восстанавливают нитриты, не разжижают желатину и не образуют индол. Анаэробы. Для своего роста требуют сложных питательных сред с кровью. Обычно их обнаруживают в организме здоровых людей (полость рта, респираторный тракт, кишечник, женские половые органы). Пептострептококки были выделены при абсцессах, перитоните, аппендиците, остеомиелите, гнойном тромбофлебите и других заболеваниях, а также в ассоциациях с другими бактериями, а иногда в чистой культуре. Чувствительны к аминогликозидам, тетрациклинам, хинолонам и другим препаратам. Пептострептококки. Род Peptostreptococcus включает несколько видов. Представляют собой грамположительные кокки, расположенные парами или в виде коротких цепочек. Жгутиков не имеют. Хемоорганотрофы, сбраживающие углеводы с образованием большого количества кислых продуктов и газа. 18