ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОМСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ. КАФЕДРА ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИИ И КОСМЕТОЛОГИИ Особенности генома T. pallidum: его значение в диагностике заболевания Выполнили: Лещенко Елизавета Сергеевна, 4 курс, пед. фак. , 442 группа; Витан Лариса Григорьевна 4 курс, леч. фак. , 417 группа. Научный руководитель: профессор, доктор медицинских наук, доцент Новиков Юрий Александрович T. pallidum Омск, 2015
Сифилис – системное инфекционное заболевание, вызываемое бледной трепонемой (Treponema pallidum), характеризуется волнообразным течением, разнообразными клиническими проявлениями с чередованием манифестных и скрытых периодов, передаваемое половым путем и являющееся причиной тяжелых поражений нервной системы, висцеральных органов, а также внутриутробного инфицирования плода. Первичный сифилис. Корковый твёрдый шанкр красной каймы верхней губы Вторичный рецидивный сифилис. Сифилитические рупии правого предплечья Ранний врожденный сифилис. Новорожденный, первые сутки. выраженная гипотрофия (по шкале Апгар 5 баллов), кожа с желтушным оттенком; гепатоспленомегалия, очаговое выпадение волос.
История развития диагностики и лечения сифилиса В 1905 г. ученик Коха микробиолог Schaudinn и клиницист Hoffmann открыли возбудителя сифилиса - бледную трепонему. В это же время начинает успешно развиваться серологическая диагностика сифилиса. В 1906 г. А. Вассерманом совместно с А. Нейссером и Бруком был разработан серологический метод выявления сифилиса, который в дальнейшем получил свое название реакция Вассермана (РВ). На сегодняшний день реакция устарела, так как является дорогостоящей, дает ложноположительные результаты, субъективно интерпретируется Август Пауль фон Вассерман (1866 -1925) Ведущими методами исследования являются иммуноблоттинг, х. МАР и ПЦР-диагностика.
Иммуноблоттинг Это метод исследования, направленный на одновременное дифференцированное определение антител к нескольким антигенам бледной трепонемы. В сыворотке пациента выявляют антитела (Ig. G) к электрофоретически разделенным и перенесенным на нитроцеллюлозную мембрану избранным антигенам T. pallidum. Диагностические иммунодетерминанты: 15 к. Да мембранный белок (Tp. N 15) – специфичный; 17 к. Да мембранный белок (Tp. N 17) – специфичный; 22 к. Да (Р 22) – неспецифичный; 45 к. Да (Tmp. A) – специфичный; 47 к. Да мембранный белок (Tp. N 47) – специфичный. Метод линейного иммуноблоттинга Результат реакции оценивается визуально.
XMAP-технология (мультиплексный анализ (multiplex assay) Позволяет одновременно детектировать в одном образце биологического материала различных возбудителей заболеваний, также инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), в частности T. pallidum. Метод построен на использовании современных технологий, таких как проточной флуориметрии, микросфер из полистирола, маркированных красными и инфракрасными флуорофорами, лазерной детекции, цифровой обработки сигнала и традиционной химии.
ПЦР Детекция бледных трепонем ведется с помощью ПЦР в реальном времени. В ПЦР исследователи остановили свой выбор на детекции лишь некоторых генов: ДНК полимеразы, 47 к. Да поверхностного белка, белка флагеллина. Также проводится мультиплексная ПЦР в реальном времени, позволяющая вести одновременную детекцию разных возбудителей, включая бледную трепонему.
Геномиз. T. pallidum геном бледной В 1998 г. группой исследователей США был расшифрован трепонемы. Полная нуклеотидная последовательность генома T. pallidum составляет 1 138 006 пар оснований. Включает в себя 42 семейства генов, ответственных за основные жизнеобеспечивающие функции. Выявлены: -потенциальные факторы вирулентности микроорганизма (12 белков, родственных «большому оболочечному белку» (major sheath protein – Msp) T. denticola; -ряд гемолизинов; -36 генов, кодирующие белки жгутиковых структур. -13 генов, кодирующих гомологи белков хемотаксиса, в том числе Che A, Che W, Che У.
Геном T. pallidum Лабораторная диагностика возбудителя сифилиса T. pallidum зависит от его антигенных свойств и особенностей генома. Ген tpr. K – продукт этого гена локализуется в наружной мембране T. pallidum и индуцирует сильный гуморальный и клеточный иммунный ответ, способный защитить кроликов от экспериментальной инфекции. Tp 92 – данный протеин в эксперименте усиливал опсонизацию и фагоцитоз бледной трепонемы макрофагами зараженных кроликов, а иммунизация этих животных рекомбинантным Tp 92 вообще предотвращала их повторное заражение. Протеин Tp 0751 – обеспечивает избирательное прикрепление бледной трепонемы к компоненту экстрацеллюлярного матрикса ламинину. Протеин массой 47 k. Da способен активировать эндотелий in vitro и стимулировать прикрепление адгезивных молекул (ICAM-1, VCAM-1), Еселектина, а также Т-лимфоцитов на поверхности эндотелия.
Геном T. pallidum Первое молекулярное типирование T. pallidum было проведено A. Pillay и соавт. в рамках исследований центров по контролю заболеваний (США, Атланта). Был выявлен ген arp (acidic repeat protein), содержащий уникальные повторы из 60 пар оснований. Группа A. Pillay проводила молекулярное типирование T. pallidum на 201 биообразце, полученном от больных сифилисом в клиниках пяти городов Южной Африке. Путем сопоставления результатов определения генов arp и tpr было идентифицировано 35 субтипов T. pallidum. В работе R. Peng и соавт. приведены результаты метаанализа публикаций, касавшихся молекулярного типирования T. pallidum и эпидемиологии сифилиса за период с 1998 г. по 2010 г. Самым распространенным оказался субтип 14 d.
Геном T. pallidum Была изучена вариабельность молекулярных типов штаммов T. рallidum с использованием молекулярных методов типирования по трем генам: arp, tpr и tp 0548. В качестве матрицы использовали тотальную бактериальную ДНК. С помощью программы Oligo 6 были подобраны пары праймеров. Амплифицированные фрагменты ДНК обрабатывали экзонуклеазой E. coli и креветочной щелочной фосфатазой для получения чистого препарата ДНК. Выравнивание нуклеотидных последовательностей выполнялось с помощью программы Mega 5 Alignment Explorer. В результате молекулярного типирования по двум генам (arp и tpr) каждому штамму T. рallidum был присвоен код, состоявший из цифрового и буквенного обозначений.
Геном T. pallidum Всего в исследовании было выявлено 6 типов штаммов: 11 d – 1 (0, 53%) штамм, 13 d – 1 (0, 53%) штамм, 14 a – 2 (1, 05%) штамма, 14 b – 6 (3, 16%) штаммов, 14 d – 179 (94, 20%) штаммов, 20 d – 1 (0, 53%) штамм.
Геном T. pallidum Типирование нуклеотидных последовательностей участка гена tp 0548 длиной 85 пар оснований в позиции 131– 215 позволило выделить дополнительно субтипы T. рallidum: a – 1 (0, 53%) штамм, c – 1 (0, 53%) штамм, f – 183 (96, 31%) штамма, g – 1 (0, 53%) штамм. В результате молекулярного типирования российской выборки штаммов T. рallidum по трем генам (arp, tpr и tp 0548) было выявлено 10 молекулярных типов T. рallidum. Доминирующим молекулярным типом среди штаммов T. pallidum, обнаруженных на территории Российской Федерации, так же как и во многих других странах мира, являлся молекулярный тип 14 (98, 4%), подтип 14 d/f (91, 03%); доля субтипов 14 b/f и 14 d/T молекулярного типа 14 составила 3, 16 и 2, 10% соответственно; на долю каждого из остальных субтипов (11 d/f, 13 d/f, 14 a/a, 14 a/f, 14 d/c, 14 d/g и 20 d/f) приходилось по 0, 53%.
Распространенность наиболее часто встречающихся субтипов штаммов T. pallidum в странах мира
Лечение сифилиса Основными препаратами для лечения сифилиса остаются пенициллины и βлактамы. Имеются факты, указывающие на возможность развития резистентности бледной трепонемы к препаратам: неудачи лечения сифилиса эритромицином, подтверждение in vitro устойчивости T. рallidum к макролидам, обусловленной мутацией в генах, кодирующих 23 S r. RNA, обнаружение T. denticola, устойчивых к тетрациклину и эритромицину.
Лечение сифилиса Для определения резистентности штаммов T. pallidum к макролидам были изучены две известные мутации в генах, кодирующих 23 S р. РНК T. pallidum, в положениях A 2058 G и A 2059 G/C. Были применены методы ПЦР и секвенирования с использованием праймеров к участку гена, кодирующего 23 S r. RNA и содержащего сайты предполагаемых мутаций. В результате было обнаружено 3 штамма с мутацией в положении A 2058 G в последовательностях участка гена, кодирующего 23 S r. RNA. Мутаций в позиции 2059 гена, кодирующего 23 Sr. RNA, обнаружено не было ни у одного из штаммов T. pallidum.
Лечение сифилиса Для выявления возможных мутаций в генах Тр47 и Tromp было проведено их секвенирование с применением праймеров к полноразмерным генам (устойчивость штамма к β-лактамным антибиотикам). На основании анализа продуктов секвенирования гена tp 47 было выявлена замена в позиции 124 гуанина на тимин, в позиции 394 – серина на аргинин. Но замена не является значимой и не влияет на устойчивость микроорганизма к β-лактамам.
Скачать презентацию ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ОМСКАЯ
Диагностика T.pallidum.pptx