Глобальная роль микроорганизмов Повсеместное распространение Способность

Глобальная роль микроорганизмов • Повсеместное распространение • Способность трансформировать любые вещества • Ключевой элемент круговорота веществ и энергии в природе • Способность накапливать биомассу • Превосходство биомассы над биомасс животных и растений • Состояние климата на планете • Патология растений, животных и человека

РОЛЬ ИНФЕКЦИИ В ИСТОРИИ ВОЙН Истинные победители военных сражений – инфекционные болезни остаются неизвестными Þ В 17 -ом веке при завоевании Сибири был союзник – натуральная оспа. Коренное население погибало массово. Нарымский край был опустошен. Þ В 18 -ом веке во время осады г. Риги русскими войсками от чумы и голода умерли 60 000 человек. Þ В период 1917 -1923 гг. только на территории Европейской части России сыпным тифом переболело 30 млн. . человек и из них 3. 0 млн. . умерло(3156 на 100 000). Þ В период 1981 -1989 гг. из Афганистана в СССР было завезено 7683 случая малярии. На один случай ранения приходилось 12 случаев инфекционных болезней - гепатиты, брюшной тиф, ОКИ. Погибло 14453 военнослужащих, а санитарные потери- 415932. Þ Американская операция в Ираке - 100 000 больных астенизирующим заболеванием неясной этиологии, названным “Синдром бури в пустыне”. Þ Огромные территории веками оставались незаселенными из-за высокого риска инфекций.

Распределение инфекционных и паразитарных болезней по уровням заболеваемости населения Беларуси в 2002 г.

24 -25 million

Смертность от инфекционных и паразитарных заболеваний (ВОЗ, октябрь 2000)

БИОГЕОЛОГИЧЕСКИЕ ЧАСЫ ЗЕМЛИ Млрд. лет назад Млекопитающие Высшие растения • Микроорганизмы (прокари- оты) возникли 3. 0– 3. 5 млрд. лет назад • Макроскопические эукариоты — 2. 0 млрд. • Царство водорослей — 1. 5 Люди Возникновение Земли Беспозвоночные Царство водорослей млрд. 1 4 • Членистоногие — 700 млн. • Беспозвоночные — 600 млн. • Птицы — 400 млн. Жизнь • Млекопитающие — 200 млн. • Человек — 1– 2 млн. лет назад Макроэукариоты 2 3 Цианобактерии и др. фототрофы Фототрофные бактерии

МИКРООРГАНИЗМЫ уникальная, гетерогенная группа самых мелких живых существ планеты бактерии грибы вирусы синезеленые простейшие прионы? водоросли Известно около 5% существующих на Земле микроорганизмов Патогенными для человека является более 1000 видов Около 500 видов бактерий нормальной флоры чековека Каждая энергетическая ниша на Земле используется определенными микроорганизмами, что подразумевает наличие огромного разнообразия микроскопических организмов

Особенности микроорганизмов • Огромные популяции ( до 1012 -1014) - быстрые темпы размножение (одна генерация - 20 минут) • Устойчивы к утрате значительной части популяции • Экстраординарны: - по восстановлению численности; - по генетическому разнообразию • Высокие темпы изменчивости определяют пластичность и высокую адаптивность к меняющимся условиям среды

Геномы некоторых патогенов

Методология • Методы классической бактериологии • Фенотипическая характеристика микроорганизмов: биохимические тесты, фаготипирование, токсинообразование, резистентность к антибиотикам • Молекулярно-биологические методы: полимеразная цепная реакция, риботипирование • Иммунологические методы

МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА • • • СЕКВЕНИРОВАНИЕ КЛОНИРОВАНИЕ ПЕРЕНОС ГЕНОВ (трансгенные бактерии, растения, животные) ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ ГЕЛЬЭЛЕКТРОФОРЕЗ НК, БЕЛКОВ АУТОРАДИОГРАФИЯ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (включая FISН - Fluorescensce in Situ Hybridization) – локализация генов (reporter genes – гены, которые легко выявить и которые встраивают в диагностических целях) БЛОТТИНГ (Northern – проба ДНК + РНК; Western – проба антител + белок; Southern – проба ДНК + ДНК; Southern-Western – проба ДНК + белок). АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ (ДНК – аррэй) ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ Х-ray CRYSTALLOGRAPHY (определение 3 -Д кристаллизованной структуры НК и белков)

Молекулярная генетика Предмет исследования - организация, репликация и экспрессия генома микроорганизма Метод исследования - секвенирование геномов микроорганизмов или их фрагментов Методологическая основа - геномика и протеомика Новая диагностическая техника (молекулярная биология) PCR - цепная полимеразная реакция - лабораторная диагностика инфекций - идентификация чистых культур - определение факторов патогенности - определение резистентности к антибиотикам ДНК-зонды и др. - те же задачи; Fingerprinting method: молекулярное типирование штаммов, молекулярная эпидемиология Определение плазмидного и белкового профиля

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ • РТ-ПЦР Клетка Патогенетически значимые гены Обычно исследуют одновременно один или два гена (КАЧЕСТВЕННЫЙ ИЛИ КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ) • Гибридизация in situ Reverse Northern Slot Blot • Custom c. DNA macroarray Амплификация антисмысловой РНК Клетки АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Профиль экспрессии генов Сравнение и сопоставление результатов • c. DNA macroarray (мембранный) • c. DNA microarray • Oligonucleotide array CLONTECH: атлас c. ДНК для нейробиологии Microarray на стеклянных пластинах на с теклянных пластинах Affymetrix GENE CHIP

Генотипирование изолятов C. difficile методом ПЦР с использованием арбитрального праймера

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОМА МИКРООРГАНИЗМОВ • Определение первичной структуры нуклеиновой кислоты генома (ДНК или РНК) определенного вида (типа, изолята) инфекционного агента или порядка (последовательности) азотистых оснований в их молекуле; • Секвенирование полного генома инфекционного агента или его части (для бактерий 16 S RNA, 23 S RNA; m. RNA);

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОМА МИКРООРГАНИЗМОВ ЦЕЛЬ: • Генетическое картирование - установление количества генов, их протяженность и локализацию; • Генетическая изменчивость; • Установление степени генетических различий или сходства изолятов от одного больного в разные периоды заболевания; • Установление степени генетических различий инфекционных агентов, выделенных от разных больных; • Установление степени генетических различий инфекционных агентов, выделенных из разных объектов, регионов, стран, географических территорий и континентов (носитель, внешняя среда, больной человек, животные и т. д. ); • Установление различий и вариабельности факторов вирулентности; • Установление связи генотипа патогена с клиникой заболеваний (формой и тяжестью течения) и резистентностью к этиотропной терапии; • Выявление направлений эволюции микроорганизмов, ее ретроспективный анализ и прогнозирование.

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ВИРУСОВ ВИЧ Гепатит А - 1/2, А, В 7 генотипов (1, 2, 3 и 7 - инфекционные для человека) Гепатит В 6 -7 генотипов, 4 субтипа и мутантные формы ВГВ (мутации в S-, С-, Х- и Р-генах генома HBV) Гепатит С 1 -11 генотипов, >100 субтипов (наиболее распространенные 1 а, 1 b, 2 a, 2 b и 3 а)

Филогенетическое дерево лентивирусов приматов SIV syk HIV-2 ROD SIV mac SIV stm SIV smm HIV-2 EOH SIV mnd SIV syk SIV smm, SIV mac, HIV-2 SIV mnd SIV I’hoest SIV agm HIV-1 ANT 70 C (0) SIV cpz US SIV cpz gab HIV-1 YBF 30 HIV-1 U 455 (A) 0, 02 замен в сайте SIV cpz, HIV-1

Применение молекулярной диагностики в области контроля за инфекцией • Выявление инфекционных агентов в окружающей среде • выявление инфекционных агентов в биологическом материале • выявление инфекционных агентов в пищевых продуктах • идентификация инфекционных агентов • определение факторов патогенности • определение механизмов резистентности • молекулярно-биологическое типирование возбудителей • контроль эффективности лечения

STM исследование S. typhimurium

Классы генов, идентифицированных STM исследованием у различных патогенов

Этапы с. DNA microarray анализа Клоны в 96 -луночном планшете (А 1) ПЦР амплификация Клетки или ткани (В 1) Выделение РНК АААА Амплифицированные клоны (А 2) поли А/ м. РНК (В 2) Приготовление гибридизационных ячеек (аrray) Панель ДНК-array (А 3) Синтез с. ДНК и (В 3) флюоресцентное маркирование Су3 Су5 Гибридизация ДНК (С) Красный лазер Зеленый лазер Кластерный анализ / анализ по алгоритму нейронной сети (F) Сканограмма (D) Анализ изображения Запись в базу данных (Е) Анализ данных

Сравнение результатов анализа сканограммы c. DNA microarray с помощью различных математических методов: median filtering (B) и adaptive filtering (С) А В С

Гибридизация к нейрочипу продуктов мультиплексной ПЦР, полученных от c. DNA из расчета на одну клетку * Спектр цветов соответствует уровню флуоресцентного сигнала: от черно - синего (низкий) до белого (высокий).

Классы генов, идентифицированных STM исследованием у различных патогенов

Метаболическая эволюция Протобионты ( 3, 6 млрд. лет назад) Анаэробные ауто- и гетеротрофные микробы и их предшественники ( 2, 5 - 3 млрд. лет назад) и их предшественники Факультативные гетеротрофные анаэробы Факультативные фототрофные анаэробы Аэробные ауто- и гетеротрофные микробы ( 2, 4 -2, 8 млрд. лет назад)