Гибридизация нуклеиновых кислот in situ Метод основан на возможности образования двуцепочечных гибридов между искусственно создаваемых на основе одноцепочечных последовательностей (рибо- или дезоксирибо-, олиго- или полинуклеотидных) мечеными зондами и комплементарными им последовательностям в мишенях – анализируемых молекулах ДНК или РНК. Для выявления участков гибридизации ДНК-пробу ( ДНК-зонд) метят какой-либо репортерной группой: ü радиоактивным изотопом, ü флуорохромом, ü ферментом, дающим окрашивание или люминесцирующий продукт, ü гаптеном, с которым связывается меченое тело и т. д.
Выявляя гибрид благодаря наличию в зонде репортерной группы можно - оценить число генов , кодирующих определенный вид РНК, - определить долю нетранскрибируемой ДНК в геноме , - установить сцепление определенных генов с другом друг - и их точное расположение на хромосомах. Метод молекулярной гибридизации обладает высокой чувствительностью (можно выявить малое количество меченого зонда ( 10 -15 и 10 -19 М) и соответственно комплементарной ему последовательности в мишени) и быстротой анализа , что позволяет использовать этот метод как для исследовательской деятельность так и для диагностики наследственных и инфекционных заболеваний в медицине, ветеринарии и растениеводстве.
Появление новых технологий молекулярной цитогенетики, основанных преимущественно на in situ гибридизации нуклеиновых кислот, значительно расширило возможности хромосомной диагностики
Молекулярно цитогенетические методы исследования
• Интерфазная цитогенетика: 1. Многоцветный бэндинг хромосом (МВС). 2. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). 3. Комбинация FISH с другими методами: -цитология + FISH; -гистология + FISH; -имунофенотипирование + FISH (FICTION); • Метафазная цитогенетика: 1. Сплошное окрашивание хромосом (Whole painting). 2. Сравнительная геномная гибридизация (CGH). 3. Кариотипирование с переменой цвета (ССК). 4. Многоцветное кариотипирование: cпекральное кариотипирование (SKY); многоцветная FISH (M - FISH, M - BAND).
Флуоресцентная гибридизация situ in
FISH – fluorescence in situ hybridization – цитогенетический метод, используемый для детекции и локализации специфических последовательностей ДНК на хромосомах, м. РНК и др. В основе методики лежит гибридизация флуоресцентно меченого ДНК/РНК зонда с комплементарной последовательностью ДНК/РНК. Выявление метки происходит с помощью флуоресцентного микроскопа. Метод FISH был введен более 30 лет назад. Он широко распространился как метод физического картирования генов на хромосомах. Позднее он стал применяться в других областях исследований (в областях клинической генетики, репродуктивной медицины, токсикологии, эволюционной биологии, сравнительной и клеточной геномики и хромосомной биологии). На данный момент FISH преимущественно используется для построения физических и генетических карт хромосом, для выявления структурных перестроек, транслокаций, микроделеций, генных амплификаций в интерфазных и метафазных хромосомах. В результате развития науки (лучшего понимания химических и физических свойств нуклеиновых кислот и хроматина), а также развития флуоресцентной микроскопии и цифровой визуализации, метод постоянно совершенствовался (произведено улучшение чувствительности, специфичности, разрешения), и было разработано много вариаций данного метода.
1) Cells are dropped on to a glass slide causing chromosomes to spread 4) Chromosomes are counter stained using DAPI 2) Fluorescently labeled probe is placed on chromosomes and sealed. 3) The probe and chromosomes are denatured, hybridised then washed 5) Slide is viewed under a fluorescent microscope
Принцип FISH-метода (иллюстрация с сайта www. nikon-microscope. ru)
Общий вид протокола для постановки FISH можно представит следующем виде: 1. Подготовка гистологического или цитологического препарата. Подготовка гистологического препарата осуществляется по стандартной схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза на предметное стекло и депарафинизация. При подготовке цитологического препарата используются специальные осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную суспензию клеток. 2. Предварительная обработка (если необходимо). Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют гибридизацию. 3. Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация. Для того, чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85 -900 С.
4. Гибридизация. После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (370 С в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов (продолжительность инкубации указана в каждом конкретном протоколе). В настоящее время для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры. 5. Промывка. После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC). 6. Контр-окрашивание. При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4, 6 -диамидин-2 фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК. 7. Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа Выполнение рутинных операций (депарафинизация, предварительная обработка, промывка) может быть автоматизировано.
Исследование теломерных участков при помощи флуоресцентного микроскопа. Совмещены изображения, полученные на стадии интерфазы (ядро) и метафазы (отдельные хромосомы). синяя окраска - DAPI.
Преимущества FISH – метода: 1. возможность исследования генетического материала в интерфазных ядрах; 2. получение объективных результатов по принципу “да/нет" - это количественный метод; 3. относительно простая интерпретация результатов; высокая разрешающая способность. Недостатки FISH - метода: 1. флуоресцентные красители быстро "выцветают"; 2. для анализа результатов необходимы высококачественный флуоресцентный микроскоп.
ДНК – ЗОНДИ И ВОЗМОЖНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
В основе метода FISH лежит реакция гибридизации между созданным по специальным технологиям ДНК - зондом представляющим собой нуклеотидную , последовательность ограниченного размера, и комплементарным ему участком ядерной ДНК исследуемого цитогенетического препарата. ДНК–зонд- главный элемент для постановки FISH несет "метку", т. е. содержит нуклеотиды, напрямую связанные с флуорохромом или с гаптеном для дальнейшей визуализации антителами, несущими флуорохром. Несвязанная меченая ДНК отмывается, а затем проводится детекция гибридизованного ДНК-зонда с использованием флуоресцентного микроскопа.
Мечение ДНК делят на прямое и непрямое. • Прямое мечение введение в ДНК репортерных элементов – – флуорохромов (родамина, диэтиламинокумарина, техасского красного и др. ). • Непрямой метод мечения - ДНК-пробу предварительно конъюгируют с промежуточными лигандами (биотином, диоксигенином, 2, 4 -динитрофенолом), присутствие которых на цитологическом препарате выявляется затем с помощью флуорохромов. В этом случае чувствительность метода намного возрастает, так как лиганд может содержать несколько сайтов взаимодействия с флуорохромом. Впервые in situ гибридизация с 32 Р-меченным зондом была описана в 1969 году. Разработка нерадиоактивных систем мечения и детекции ДНК зондов сделала метод in situ гибридизации безопасным, простым в исполнении и менее трудоемким при обработке результатов. Флуоресцентные красители являются мягкими и простыми в употреблении, могут храниться неопределенно долго, дают высокое разрешение, и позволяют одновременно исследовать несколько последовательностей ДНК.
Зонды: одноцепочечные/двуцепочечные ДНК/РНК первично/вторично меченые зонды. Зонды метятся: 1) напрямую: путем вставки нуклетидов, к которым прикреплен флюорохром (ПЦР или nick translation) 2) через репортерную молекулу (пр: digoxigenin, biotin) к которой крепятся флюоресцентно меченые антитела. Для усиления сигнала можно использовать вторичные, третичные и т. д. антитела, меченые флюоресцентной меткой. DNase nicks DNA Nick Translation DNA polymerase I adds new nucleotides to the 3’ hydroxyl DNA polymerase I removes individual bases from the 5’ end Визуализация хромосом: c помощью DAPI (2 mg/ml). 4’, 6 -diamidino-2 -phenylindole; сильное связывание с A-T богатыми участками ДНК; возбуждение UV светом; эмиссия 461 nm (blue).
В настоящее время можно выделить несколько основных подходов, широко используемых современной молекулярной цитогенетикой: • Идентификация материала протяженных хромосомных районов и целых хромосом. • Детекция в интересующем районе конкретной последовательности ДНК. • Анализ нарушения баланса отдельных хромосомных районов. Для идентификации материала протяженных хромосомных районов и целых хромосом широко используются хромосом специфичные и район-специфичные ДНК-зонды (“painting probes”).
Характеристика зондов различных типов 1. локус-специфичные зонды(LSI - locus - specific identifiers, связывающиеся с определенными участками хромосом. ) Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой (неповторяющимися) последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом. Они предназначены для выявления диагностически и прогностически значимых хромосомных аберраций при различных патологических состояниях (моносомии и трисомии по отдельным хромосомам). Наиболее широкое распространение этих проб получено в пренатальной цитогенетической диагностике, особенно в исследованиях клеток хориальной ткани, интерфазных ядер амниоцитов.
2. ДНК - пробы к теломерным участкам хромосом (TEL telomericprobe) предназначены для выявления делеций и перестроек, затрагивающих концевые участки плеч хромосом. Такие зонды специфичны для р- или q- плеч хромосом и комплементарны участку длиной около 300 т. п. н. от конца хромосомы. Как правило, ДНК - зонды для коротких и длинных плеч хромосом связаны с разными флуорохромами, что позволяет выявлять на одном цитогенетическом препарате оба теломерных участка хромосомы.
3. центромерные зонды-повторы, альфоидные или хромосомные нуменаторы (CEP – centromere. Enumeration. Probe) это хромосомо-специфические ДНК-пробы, представленные последовательностями тандемных альфа- и бета-сателлитных повторов. Эти повторы располагаются преимущественно в центромерных или прицентромерных гетерохроматиновых участках хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа, 4. зонды на всю хромосому, цельно-хромосомный зонд (WCP– Whole-Chromosome-Painting являются набором ) небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно "раскрасить" всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.
Области применения FISH широко используется для решения следующих клиникодиагностических задач: 1. Перимплантационная пренатальная и диагностика хромосомны аномалий. Используется в клиниках экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и перинатальных центрах. Позволяет своевременно (до имплантации эмбриона в случае ЭКО или на ранних стадиях развития плода) выявить генетические нарушения у будущего ребенка и принять необходимые меры. 2. Онкогематология. Онкогематологические заболевания возникают в результате различных хромосомных аббераций, поэтому для их диагностики используют соответствующие CEP и LSI зонды. 3. Диагностика солидных опухолей. В настоящее время устанавливается все больше причинноследственных связей между развитием конкретных онкологических заболеваний и специфичных для них изменений в геноме. Поэтому при использовании соответствующих ДНКзондов можно проводить онкологическую FISH-диагностику.
Вариации FISH-метода
Интерфазнаяцитогенетика: Комбинация FISH с другими методами: -имунофенотипирование FISH (FICTION); + FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and Interfase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasms) – для исследования опухолевых клеток. Для этого анализа используют неокрашенные мазки крови, костного мозга или препараты других тканей. 1 этап - препараты инкубируют со специфическими моноклональными антителами, 2 этап - проводят конъюгацию с флуорофорами для последующей визуализации комплекса антиген-моноклональное антитело. 3 этап - осуществляют гибридизацию in situ с ДНК-зондами. Для выявления моноклональных антител и ДНК-зондов используют флуорофоры, различающиеся по цвету. Изучение препарата под флуоресцентным микроскопом при наличии необходимого набора фильтров позволяет одновременно проводить анализ иммунофенотипа гибридизационных и сигналов в интерфазных ядрах.
Chromosomaldeletionof TNFAIP 3 in c. HL detectedby interphasecytogenetics. FICTION analyses of. representative c. HL cases combining. CD 30 expression(red) and FISH probes for TNFAIP 3 and chromosome 6 centromere (blue [b]). In the double-color assays in A–C and E and F, the TNFAIP 3 probe is labeled in green (g); in the triple-color assay applied in D, the TNFAIP 3 probe gives a g/orange colocalized (co) signal. Two different strategies are used to display double- and triple-color FISH assays in combination with CD 30 immunofluorescence; i. e. , double-color assays (A–C and E and F) are shown using a triple-color display, whereas a false multicolor display as obtained by Isis software is applied for the triple-color assay (D) to simultaneously show four colors (i. e. , CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] and orange, and chromosome 6 centromere [b]).
Цифровая запись микроизображений открыла возможность переведения в псевдоцвета не только комбинации флуорофоров но и соотношения их , интенсивностей
Многоцветное окрашивание хромосом ( Muli. Color Banding – МСВ) Данный метод предназначен не для полного анализа всех хромосом, а для проведения детального анализа отдельной хромосомы. Локус-специфичные ДНК-зонды метят различными флуорофорами или комбинациями флуорофоров так, что уровень сигнала каждого из ДНК-зондов варьирует по интенсивности. Перекрывание профилей интенсивности сигналов ДНК-зондов обеспечивает вариации соотношений интенсивностей флуоресценций различных флуорофоров вдоль хромосомы. Отношения интенсивностей могут быть переведены в псевдоцвета, и, таким образом, каждой точке изображения, а, следовательно, каждому из хромосомных локусов, будет соответствовать свой псевдоцвет. Данный вариант многоцветного FISH-метода оказался высокоэффективным при анализе не только межхромосомных, но и внутрихромосомных перестроек при онкологических заболеваниях. Однакодля его успешного применения необходимо предварительно определить хромосому , которая будет исследована. Данный метод молекулярной цитогенетики подходит для анализа нарушений кариотипа, ассоциированных с определенными хромосомами.
К настоящему времени созданы наборы ДНК-зондов, обеспечивающ проведение МСВ для всех хромосом человека Многоцветный бэндингпятой хромосомы человека (иллюстрация Meta. Systems Gmb. H) (in situ гибридизация район-специфичных ДНК-библиотек хромосомы 5; профили сигналов район-специфичных ДНК-библиотек на хромосоме 5; многоцветный бэндинг хромосомы 5; идиограмма хромосомы 5; флуорохромы, использованные для МСВ).
Метафазная цитогенетика, исторически возникшая раньше интерфазной, позволяет определять широкий спектр хромосомных нарушений, но для этого необходимо, чтобы исследуемые клетки находились на стадии метафазы мейоза.
Многоцветное кариотипирование Анализ осуществляется при использовании ДНК зондов сплошного окрашивания к плечам или целым хромосомам (зонды WCP - whole chromosome paint). Такие зонды гибридизуются с многочисленными короткими последовательностями ДНК, расположенными по всей длине хромосомы. Таким образом, при изучении под флуоресцентным микроскопом хромосома выглядит равномерно окрашенной в определенный цвет.
ДНК - зонды, используемые для такого анализа, состоят из смеси зондов сплошного окрашивания для полного набора хромосом человека, помеченных с помощью комбинации из нескольких флуорохромов, соотношение которых подобрано индивидуально для каждой пары хромосом. Использование соответствующих методов регистрации и компьютерных программ анализа изображения, оценивающих интенсивность свечения всех флуорохромов для каждой точки изображения, позволяет провести кариотипирование, при котором каждая пара хромосом имеет свой уникальный "псевдоцвет".
M-FISH (multitarget multifluor multicolorили multiplex. FISH) , , является общим названием для традиционных многоцветных FISH, использующих комплекты флуорохром-специфичных фильтров. Принцип M-FISHзаключается в раздельной цифровой регистрации сигнала всех используемых флуорохромов, что достигается последовательной сменой комплектов фильтров. Все изображения записываются в отдельные файлы, что позволяет проводить их эффективную обработку, связанную с разделением сигнала и фона, а также количественной оценкой сигнала. Обработка всей записанной информации с помощью специального программного обеспечения переводит информацию об уровне сигналов флуорохромов в каждой точке изображения в псевдоцвета. Одним из основных ограничений числа используемых ДНК-зондов является число доступных флуорохромов, с неперекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии, и наличие соответствующих комплектов фильтров.
24 -цветная FISH Наиболее широко M-FISH используется как 24 -цветная FISH для одновременной идентификации материала всех хромосом человека. Она обладает высокой эффективностью при детекции хромосомных транслокаций, но не предназначена для выявления делеций и инверсий. Однако, эта проблема может быть частично решена одновременной окраской хромосом DAPI, что дает возможность проведения анализа дифференциальной исчерченности хромосом, хромосомная принадлежность материала которых уже идентифицирована. К сожалению, необходимо заметить, что качество DAPI-бэндинга хромосом после M-FISH существенно уступает GTGдифференциальной окраске и даже DAPI-бэндингу после обычной in situ гибридизации.
Rx. FISH Принцип M-FISH был использован для создания многоцвет бар кода хромосом человека и метода многоцветного бэндингахромосом, основанного на межвидовой in situ гибридизации. В отличие от 24 цветной FISH этот метод позволяет непосредственно выявлять часть внутрихромосомных перестроек. ДНК зонды используемые в Rх. FISH, помечены комбинацией , 3 -х флуорохромов, что обеспечивает 7 псевдоцветов. Они специфично окрашивают отдельные районы хромосом, создавая их цветную исчерченность. Такая особенность ДНК проб для Rх. FISH обусловлена способом их получения. Они представляют собой хромосом специфичные ДНК библиотеки двух видов гиббонов: Hylobates concolor и Hylobates syndactylus.
В результате интенсивных хромосомных перестроек, имевших место при формировании современных видов гиббонов, материал их хромосом оказался сильно перетасованным в сравнении с организацией хромосом у человека, хромосомы которого известны своим консерватизмом. Отношение хромосомы 1 человека к хромосомам гиббонов приведен рисунке 1,
на рисунке 2 приведен общий вид хромосом человека полученный в результате Rх. FISH. а) Метафазная пластинка б) Раскладка хромосом.
Однако RXFISH имеет достаточно серьезные ограничени - перестройки хромосом, имевшие место внутри одного цветного RX-бэнда не могут быть выявлены с помощью этого метода, если они не приводят к значительным и легко видимым изменениям размера этого бэнда. - зонды окрашивают несколько хромосомных районов разных хромосом в один псевдоцвет. Тем не менее, при увеличении числа используемых флуорохромов несомненно, метод RXFISH, , будет более информативным, чем рутинная 24 -цветная FISH.
К достоинствам RXFISH в настоящее время следует отнести следующие пункты: Метод позволяет осуществлять анализ всего генома человека в одном эксперименте многоцветной FISH. Имеются в наличии коммерчески доступные наборы меченых ДНК проб и необходимых систем детекции. Метод позволяет проводить быструю идентификацию значительной части внутри - и межхромосомных перестроек. Возможна автоматическая идентификация метафазных хромосом “цветного бэндинга”. Для каждой хромосомы человека существует уникальный цветовой бар код. RXFISH интегрирован в рабочую станцию Cyto. Vision и стандартные системы флуоресцентной микроскопии.
Спекральноекариотипирование (SKY-spectralkaryotyping ) Основные принципы анализа микроскопических изображений при спектральном кариотипировании практически не отличаются от используемых при M-FISH. Отличия связаны со способом регистрации изображения. Технология SKY позволяет в ходе одного измерения получать спектральные кривые для всех точек изображения, вне зависимости связано ли это с эпифлуоресценцией или с традиционной световой микроскопией. Для спектрального кариотипирования всех хромосом человека используют пять флуорохромов один в зеленом спектре, : два в красном и два в инфракрасном. Возбуждение и эмиссия всех флуорохромов, используемых при мечении ДНК зондов, проходит при одном комплекте фильтров, что позволяет избежать их последовательной смены, промежуточных фокусировок, а, следовательно, и связанных с ними проблем, таких как пространственный сдвиг изображения, определение пороговых значений и сегментационных масок. На основании анализа спектральных кривых определяетс наличие или отсутствие в данной точке конкретных флуорохромов.
Следующим шагом является процедура классификации, которая позволяет прямо и однозначно определять хромосомную принадлежность анализируемого материала. Это обеспечивает надежную идентификацию (с точностью до хромосомы) материала маркерных хромосом, а также дериватов хромосом, являющихся следствием разнообразных перестроек. Большим достоинством SKY является то, что параллельно спектральному имиджу регистрируется окраска DAPI. Программное улучшение DAPI бэндинга позволяет достичь дифференциальной исчерченности по качеству близкой к GTG-бэндингу. Возможность параллельного анализа спектрального имиджа и качественной дифференциальной окраски хромосом значительно упрощает интерпретацию результатов SKY и позволяет более точно определять точки хромосомных разрывов. К несомненным достоинствам SKY относится возможность использования флуорохромов с перекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии, что значительно расширяет список пригодных к использованию флуорохромов, а также увеличивает число, флуорохромов, которые могут быть использованы одновременно. Включение в список нового флуорохрома не требует приобретения нового комплекта фильтров, так как для проведения SKY достаточно одного блока фильтров для спектральной FISH и одного блока фильтров для DAPI.
К недостаткам SKY можно отнести: - длительное время экспонирования, необходим для записи микроскопических изображений. - SKY является несколько менее эффективным чем М-FISH, в случае необходимости проведения исследований с относительно небольшими по разме ДНК-зондами.
Кариотипирование переменой цвета (ССКс Color changing karyotyping ) Этот метод основан на анализе различия в длине сигнала между образцами ДНК, гибридизованными с ДНК - зондами, связанными с флуорохромами, и с ДНК - зондами, несущими антитела. Метод осуществим при наличии всего 3 фильтров и не требует специальных камер и программного обеспечения. Для идентификации хромосом проводят одну гибридизацию и получают два изображения. В основе метода лежит различие в длине флуоресцентного сигнала, поскольку время экспозиции проб ДНК, связанных с антителами, на 80 - 90% меньше, чем проб, связанных с флуорохромами. После реакции гибридизации мазки экспонируют с соответствующими первичными антителами, а затем проводят визуализацию, получая первый снимок. Затем препараты экспонируют с вторичными антителами и авидином, связанными с теми же флуорохромами. Мазки можно контрокрасить, используя DAPI.
В дальнейшем снова получают снимки препаратов, используя поочередно 3 фильтра. Эти изображения сопоставляют, используя специальное программное обеспечение, и получают второй снимок, на котором будут видны только хромосомы, связанные с определенными антителами. Таким образом, некоторые хромосомы будут флуоресцировать только на первом или втором снимке, в то время как другие будут изменять свой цвет на разных снимках.
Сравнительная геномная гибридизация (CGH) Метод был создан для выявления количественных нарушений в геноме. Он основан на проведении реакции гибридизации in situ с использованием в качестве ДНК - зонда всего генома. Выделенную и нормальную донорскую ДНК метят флуорохромами разного цвета, превращая их таким образом в ДНК зонды. Эквивалентные количества этих зондов смешивают и используют при гибридизации с контрольным цитогенетическим препаратом. После проведения FISH метафазы анализируют на флуоресцентном микроскопе, определяя с помощью специализированной программы компьютерного анализа изображения интенсивность флуоресценции двух флуорохромов по всей длине каждой хромосомы.
При отсутствии количественных изменений в кариотипе исследуемого образца будет наблюдаться определенное соотношение интенсивности свечения двух флуорохромов. В случае амплификации генов интенсивность сигнала соответствующего флуорохрома будет усиливаться, а в случае потери части генетического материала, наоборот, - ослабевать. Таким образом, CGH позволяет выявить геномный дисбаланс, но этот метод нельзя использовать для обнаружения сбалансированных транслокаций и инверсий, а трисомии и делеции можно определить только в том случае, если размер несбалансированного участка составляет не менее 10 млн. пар нуклеотидов.
Хромосомный дисбаланс в исследуемом образце оценивают по разнице в интенсивности флуоресценции двух разных флуорохромов с помощью вычисления флуоресцентного отношения (ФО).
Метод CGH имеет ряд достоинств по сравнению с другими методами анализа изменений генома: Во-первых, он не зависит от источника исследуемого материала, и может быть успешно проведен с малым количеством тестируемой ДНК, включая архивный материал. Во-вторых, он позволяет получить детальную информацию о потерях или увеличении числа копий генетического материала по всему геному в одном эксперименте. В третьих, метод CGH не требует приготовления препаратов метафазных хромосом из исследуемой ткани, то есть не зависит от процесса культивирования клеток и связанных с ним артефактов.
Геномная гибридизация situ (genomicin situ hybridization in , GISH) – вариант метода гибридизации situ, заключающийся в in том, что для гибридизации с фиксированными образцам качестве флуоресцентно меченного зонда используется суммарная геномная ДНК одного вида организма, с которой конкурирует суммарная геномная ДНК другог вида организма; используется для определения межвидовых и внутривидовых различий геномов, хромосомных перестроек, делецийи замещений.
Вариации FISH 1) Q-FISH – quantitative FISH: • Разработан Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward, and P. M. Lansdorp. 1998. Short telomeres on human chromosome 17 p. Nat. Genet. 18: 76 -80. • Количественный метод. • Разработан для работы с проточной цитометрией. • Изначально применялся для измерения длины хромосом (разрешение: 200 bp) путем подсчета числа теломерных повторов. • Используются PNA-конъюгированные зонды. • Изначально исследовали метафазные хромосомы (собственно QFISH), теперь данный метод применим и для интерфазных хромосом (IQ-FISH). • Q-FISH проводится на культуре клеток, срезах тканей (оба на стеклах). • На данный момент Q-FISH является важным инструментом в изучении роли теломеров в процессах старения и ракообразования.
2) PNA-FISH – Peptide nucleic acids FISH:
PNA-FISH – Peptide nucleic acids FISH: • Пептидные нуклеиновые кислоты (PNAs) – синтетические аналоги ДНК, в котором сахарный остов фосфата дезоксирибозы, поддерживающий азотистое основание, заменен на незаряженный пептидный остов. • В результате такой структуры: при гибридизации PNA-олигомерного зонда с комплементарной ДНК/ РНК не происходит электростатического отталкивания. • PNA-DNA (PNA-RNA) дуплексы гораздо стабильнее натуральных гомо/гетеродуплексов. • Высокая специфичность связывания PNA-DNA: PNA-DNA гибридизация намного чувствительнее в отношении несоответствия пар оснований, чем DNA-DNA гибридизация. Так, с помощью PNA-зонда можно различить два центромерных повтора, различающиеся всего по одной паре оснований. • PNA обладает относительной гидрофобностью (по сравнению с DNA), вследствие чего PNA лучше диффундирует сквозь клеточные стенки => широкое применение в микробиологии. • На основании высокой специфичности связывания: считается, что PNA технология в скором времени станет основой для создания аллель-специфичных зондов для in situ гибридизации. • Применяется в генетике, цитогенетике, эпигенетике, микробиологии и др.
3) Flow-FISH – FISH for flow cytometry: • Предложен в 1998 г. : Rufer, N. , Dragowska, W. , Thornbury, G. , Roosnek, E. & Lansdorp, P. M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nature Biotechnol. 16, 743– 747 (1998). • Комбинация Q-FISH и проточной цитометрии, позволяющая анализировать (измерять) сигнал и сортировать. • Для flow-FISH используется клеточная суспензия (для измерение длины теломеров хромосом), хромосомные спреды и выделенные хромосомы (для дальнейшего картирования). • Как и в Q-FISH, используются PNA-меченые теломерные зонды (например, для визуализации и измерения длины теломерных повторов) • Главное преимущество – более быстрый метод (анализ/сортировка большого количества клеток/хромосом). • Широко применяется для исследования разных проблем: старения, сохранение теломер, исследование суспензий гемотопоетических стволовых клеток ex vivo, исследование бактерий.
Multiparametric analysis allows for differentiation of cell types within one sample, allowing for internal control, and analysis of leukocyte subtypes.
Преимущества flow-FISH : • Легко воспроизводимый результат • Возможность анализировать подгруппы клеток в популяции используя физические иммунофлюоресцентные и маркеры • Лучшая производительность, чем в Q-FISH • Возможность получать количественные данные по флюоресценции тысяч клеток.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЫДЕЛЕННЫХ ХРОМОСОМ с помощью методов проточной цитометрии 1. Сортировка хромосом с помощью проточной цитометрии - Кариотипирование с помощью проточной цитометрии используется для дальнейшего картирования генов и построения хромосомных библиотек. - Идентификация и локализация генов на сортированных хромосомах производится с последующим применением методов FISH/ метода PRINS (primed in situ labeling) или его вариаций и хромосом-специфической ПЦР. - К 2011 г. успешно сортированы пока только хромосомы 17 видов культивированных растений. - Сортировка метафазных или пахитенных хромосом с высоким индексом деления.
Флуоресцентная метка: - Хромосомы метятся флуорохромами, специфичными к нуклеиновым кислотам. - Флюорохромы выбираются в соответствии 1) со специфичностью к азотистыми основаниями, 2) с условиями эксперимента (в том числе учитывая длины волн имеющихся лазеров). 1. Для моновариантного анализа используют краски, не специфичные к A-T или G-C парам: • propidium iodide(пик возбуждения: 535 нм, эмиссии: 617 нм, требуемый лазер: 488 нм-аргоновый лазер или лампа + long-pass filter) • ethidiumbromide (пики возбуждения: 300 и 520 нм, эмиссии: 600 нм, требуемый лазер: 488 нм-аргоновый лазер или лампа + long-pass filter) Данные метки красят ДНК не зависимо от содержания A, G, T или Cазотистых оснований. 2. Для бивариантного анализа используют: • chromomycin (специфичен для G-C пар оснований), пик A 3 возбуждения: 458 нм, эмиссии 580 нм. Лазер: , 458 нм минимум 400 м. В мощность. • Hoechst 33258(специфичен для A-T пар оснований), возбуждение: 351 -364 нм, эмиссия: 470 нм. Лазер: 351 -364 нм (мощный). Лазеры должны быть разделены во времени и пространстве из-за частичного перекрытия спектров флюорохромов.
2. Исследование хромосом/ нуклеотидных последовательностей после сортировки (для построения физических и генетических карт и т. п. ) • FISH • BAC-FISH • PRINS • C-PRINS • Исследование больших геномов с длинными хромосомами. • Картирование последовательностей с большим количеством повторов (пр: теломерных и центромерных участков). • Использование коротких зондов. • Благодаря большому количеству повторов сигнал сильный. • Стандартная величина зонда: 15 – 30 нуклеотидов. FISH
Проблемы FISH: • Сложно локализовать однолокусные последовательности ДНК (т. е. неповторяющиеся уникальные последовательности ДНК), т. к. при использовании стандартных коротких зондов сигнал будет очень слабым. • Увеличение длины зонда до нескольких килобаз для усиления сигнала приведет к снижению чувствительности и => к неспецифическому связыванию. • Решение: BAC-FISH -BAC-FISH – комбинация метода FISH и использования клонов геномной ДНК, встроенной в бактериальные искусственные хромосомы (BAC), позволяющие встраивать большие последовательности ДНК. -Эффективный метод для идентификации и картирования отдельных хромосом организмов с небольшими геномами. В качестве зонда используется BAC-зонды, overgos (overlapping oligonucleotides).
Альтернатива FISH: PRINS • PRINS (primed in situ labeling) – способ мечения хромосом с помощью отжига олигонуклеотидного ДНК-праймера с гомологичной последовательностью денатурированной хромосомной ДНК и последующего энзиматического удлинения праймера in situ мечеными нуклеотидами. • Впервые описан Koch et al. в 1989 г. (Koch, J. E. , Kølvraa, S. , Petersen, K. B. , Gregersen, N. , and Bolund, I. (1989) Oligonucleotide-priming methods for the chromosome-specific labelling of alpha satellite DNA in situ. Chromosoma 98, 259– 265). • PRINS является альтернативой FISH. • Применяется для локализации нуклеотидных последовательностей, распознавания и подсчета метафазных или интерфазных хромосом или хромосомных пар (в т. ч. хромосомной анеуплоидии). отжиг немеченого праймера (праймер – затравка) с исследуемой ДНК элонгация затравки с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и меченых нуклеотидов остановка реакции (присоединение блокирующей молекулы на 3’ -конец) Праймер: • фрагмент рестрикции • ПЦР-продукт • олигонуклеотид Мечение нуклеотидов: - прямое (флюорохромами) - непрямое (biotin/ dig флюорохромконъюгированный avidin/ anti-dig) - В результаты каждой PRINS реакции можно идентифицировать только одну пару гомологичных хромосом (одну хромосому). Следующую реакцию PRINS на том же стекле можно проводить только после блокировки предыдущей. - Применяется для последовательностей ДНК с большим количеством повтором.
Преимущества PRINS: 1. Требуется минимальная информация о последовательности, необходимая для синтеза олигонуклеотидного праймера. 2. Наиболее быстрый и простой метод детекции интересующей нас последовательности на хромосоме (по сравнению с использованием тяжелых зондов для FISH, гибридизующихся очень большой промежуток времени). 3. Исключение стадии мечения зонда. 4. Возможность элонгировать праймер мечеными нуклеотидами для усиления c-PRINS сигнала при детекции коротких уникальных последовательностей. Для выявления малокопийных повторов или коротких уникальных последовательностей применяется более чувствительный метод – cycling PRINS (c -PRINS). C-PRINS предложен Gosden et al. в 1991 г. , улучшенный широко используемый протокол – Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Localisation of DNA sequences on plant chromosomes using PRINS and C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71 -82). C-PRINS включает в себя серию термальных циклов, аналогичных ПЦР.
Sheath fluid for FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40 m. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Flow sorting of mitotic chromosomes in common wheat (Triticum aestivum L. ). Genetics. 2000; 156(4): 2033 -41) -Mg. So 4 buffer without dithiothreitol (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y. C. Song. Flow-sorted chromosomes: a fine material for plant gene physical mapping. Caryologia. 2006, vol. 59, № 2: 99 -103) -autoclaved 0. 1% (wt/vol) Na. Cl -50 m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Chromosome Sorting in Tetraploid Wheat and Its Potential for Genome Analysis. Genetics. 2005, 170(2): 823– 829) -Chromosome-stabilizing polyamine buffer (protein-containing sheath fluid) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2 nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)
Скачать презентацию Гибридизация нуклеиновых кислот in situ Метод основан на
Лекция 6_Гибридизация ФИШ.ppt