Генотипирование бактериальных штаммов при решении вопросов распространения инфекций д. б. н. Терлецкий В. П. ФГБУ ВНИВИП ФАНО ФГБУ ВНИИГРЖ ФАНО Санкт-Петербург, Пушкин, Московское ш. 55 а, 196601 моб. +7 921 558 7957, факс (812) 465 9989, e-mail valeriter@mail. ru 1
2 1. Терминология 2. Генотипирование. Зачем? 3. Методики генотипирования 4. Генотипирование ДРИМ 5. Примеры генотипирования
3 Цель работы состояла в разработке и апробации на примере изолятов бактерий, принадлежащих к разным биологическим видам, нового метода генотипирования Генотипирование – это идентификация бактериальных штаммов методами молекулярной генетики Штамм – это изолят, отличающийся от других изолятов по каким-либо генетическим или фенотипическим признакам Изолят – чистая культура микроорганизма, происходящая из одной живой клетки, выделенная из какого-либо объекта
Типирование микроорганизмов Ш Выявление путей распространения инфекций; Ш Идентификация резервуара инфекции; Ш Генетическая паспортизация полезных штаммов; Ш Определение лекарственной устойчивости; Ш Выявление причин персистентной инфекции; Ш Мониторинг эффективности программ вакцинирования; Ш Эффективность применения бактериальных препаратов; Ш Популяционные исследования, филогения. 4
Пути распространения инфекции Объект 1 1 2 1 3 1 4 Объект 2 Объект 3 Объект 4 5
6 Методы типирования бактерий фенотипические молекулярно-генетические специфические локусы MLST T-RFLP ERIC-PCR REP-PCR BOX-PCR ribotyping множественные анонимные локусы PFGE AFLP RAPD DDSL
e Sp I e Sp S I S Type I (Stu. I–Stu. I) Основные этапы DDSL S S S Type II (Stu. I –Spe. I ) e Sp I e Sp S 7 I pe S S S Type III (Spe. I – Spe. I) CTAG GATC Bio-d. CTP fill-in reaction by DNA-polymerase Bio C GATC Электрофорез CTAG C Bio C GATC I
Время, необходимое для выполнения основных этапов генотипирования ДРИМ 0 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0 6. 0 выделение ДНК……… расщепление/ мечение…………. подготовка геля……………… электрофорез…………. . перенос ДНК…………………. . детекция ДНК…. . . . 7. 0 8
Преимущества метода генотипирования ДРИМ 9 Ø высокая дискриминационная способность, D > 0. 95; Ø относительная быстрота анализа; Ø универсальность; Ø доступность оборудования; Ø экологичность Основана на гель-электрофорезе
Видовая специфичность генотипирования 3 штамма E. Coli Сальмонелла 10
11 Clostridium difficile 1 2 3 4* 5 6 7 Pseudomonas aeruginosa Salmonella enterica 1* 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 * - reference strain of Pseudomonas aeruginosa
R 12618 12585 12584 12578 12422 R 12391 10292 10290 9825 9817 R 9816 9469 9465 9442 9461 R 5555 5516 5203 5180 4866 R M Генотипирование 20 клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa (R – референтный штамм, М – маркер 12
Распределение изолятов P. aeruginosa по кластерам с помощью программы Bio. Numerics 13
Реф 27110 27109 27108 27107 27106 27105 Реф 27767 27766 27762 27760 27759 18089 Реф 18082 18080 18079 18078 18077 18076 Реф 18042 18041 18040 18039 18038 18037 Реф Генотипирование 24 изолятов Clostridium difficile методом DDSL c применением рестриктаз Mlu. I и Nsi. I 14
Генотипирование 37 изолятов S. aureus методом DDSL c применением рестриктаз Xho. I и Bsu. RI M 1 2 3 4 5 10 7 8 1 t 3 t 4 t 5 t 6 t 7 t 8 t 9 t 12 t 15 t 17 t 10 t 11 t 13 t 16 t 18 t 19 t 20 t 21 t 22 t M 6 s 11 s 56 s 30 s 3 s 26 s 43 s 16
Генотипирование изолятов кишечной палочки номера генотипов номера идентичных изолятов 1 номера генетически близких изолятов 1; 2; 3; 4; 6; 7; 8; 10; 11; 12; 13; 14 2 5 (отличие на 3 фрагмента от генотипа 1) 3 15 (отличие на 2 фрагмента от генотипа 1) 4 номера ген-ки удаленных изолятов 16 (отличие на 3 фрагмента от генотипа 1) 5 21; 22 6 23; 25; 26 24 (отличие на 2 фрагмента от генотипа 6) 7 8 9 28; 29 27 (отличие на 2 фрагмента от генотипа 8 ) 10 9 11 17 12 18 13 19 14 20 17
Comparison of genotyping results obtained by PFGE and DDSL techniques on a set of 27 S. aureus ST 398 isolates associated with cases of bovine mastitis Number of PFGE types – 12, D = 0, 93 Number of DDSL types – 16, D = 0, 95 18
Число различающихся фрагментов ДНК между индивидуальными изолятами протея № изолята 1 Pv 5 Pv 6 Pv 7 Pv 8 Pv 11 Pm 12 Pv 1 Pv 0 19 5 Pv 6 Pv 7 Pv 8 Pv 11 Pm 12 Pv 5 1 1 8 40 10 0 3 3 7 45 10 0 0 11 40 11 0 45 7 0 47 0
20 1 6 7 5 8 12 11 Генетические взаимоотношения в группе бактериальных штаммов P. vulgaris (1, 5, 6, 7, 8, 12) и P. mirabilis (11)
21 Выводы 1. Разработан эффективный и быстрый метод генотипирования микроорганизмов (ДРИМ), который можно использовать в молекулярной эпизоотологии 2. Метод ДРИМ применим микроорганизмов к разным видам 3. Метод можно использовать в эпидемиологических и эпизоотологических исследованиях
Спасибо за в н и м а н и е! 22
Скачать презентацию Генотипирование бактериальных штаммов при решении вопросов распространения инфекций
Терлецкий 17 10.ppt