Генотерапия ВИЧ Общая характеристика ВИЧ вирус иммунодефицита

Генотерапия ВИЧ

Общая характеристика ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) - Т-лимфотропный ретровирус ІІІ типа РНК-содержащий, клетки-мишени – ДНК-содержащие клетки человека. Ферменты: обратная транскриптаза (ревертаза), интеграза, протеаза. Специфические маркеры – p 24, gp 41, gp 120, gp 160 Геном вируса включает 3 структурных гена (характерны для всех ретровирусов) и 6 регуляторных (обеспечивают регуляцию репликации, синтеза структурных белков вируса). Типы возбудителя: ВИЧ-1 - распространен во всех странах света; ВИЧ-2 - в основном в Западной Африке, но уже выявляется в разных странах Европы и Америки.

(gp 41, gp 120)

Строение вируса 1 капсомеры интеграза. дцевина братная риптаза. Схема строения вируса иммунодефицита человека: • 1 — капсомеры; • 2 — геном; • 3 — липопротеиновая оболочка (суперкапсид); • 4 — гликопротеины. 2. геном (2 молекулы РНК) 3. липопротеиновая оболочка протеаза. 4. гликопротеины.

ПАТОГЕНЕЗ ВИЧ-инфекции Клетки-мишени для ВИЧ (все, имеющие на своей поверхности рецепторы CD 4) - Т-лимфоциты (хелперы), макрофаги, а также В-клетки, микроглия, клетки Лангерганса и др. Этапы инфицирования: связывание gp 120 вируса с CD 4 клеткимишени, вхождение вируса в клетку с участием gp 41. Превращение РНК вируса в ДНК (обратная транскриптаза). Встраивание ДНК-копии в геном клетки (интеграза) – провирус. Репликация вируса – затем синтез вирусных белков, сборка на клеточной мембране, «дозревание» вируса (протеаза). Непосредственное патогенное действие ВИЧ на клетку (цитопатический эффект). Разрушение материальной основы иммунитета - клеточного (развитие оппортунистических инфекций, снижение иммунного контроля за образованием атипичных клеток) и гуморального. Прямое онкогенное действие ВИЧ на определенные ткани.

Клетки мишени Т-лимфоциты,

С помощью поверхностного гликопротеина gp 120 вирус присоединяется к CD 4 рецептору и одному из двух корецепторов, находящихся на поверхностной мембране клеток. Для Т-лимфоцитов корецептором является. CXCR-4, а для макрофагов —CCR 5.

Инфицирование Этап 1. Прикрепление Приближение Прикрепление ВИЧ CD 4+ (T-лимфоцит) Рецептор Корецептор ССR 5

Этап 2. Связывание с корецептором Конформационные изменения Домены gp 41

Этап 3. Слияние Внедрение и «зацепление» После внедрения gp 41 «скручивается» и сцепляет мембраны вируса и клетки

Обратная транскрипция • Синтез ДНК по матрице РНК (Обратная передача генетической информации). • Ретровирусы, в том числе ВИЧ, конвертируют вирусную РНК в провирусную ДНК, которая интегрируется в хромосому клетки хозяина. • Этот процесс выполняет фермент ВИЧ – обратная транскриптаза.

Динамика репродукции ВИЧ • 10 миллиардов новых вирусных частиц продуцируется ежедневно. • 200 миллионов CD 4 клеток разрушаются ежедневно (у 2 раза больше, чем продуцирует система гематопоэза). • Период полураспада свободного вируса – 6 ч. • Период полураспада вируса в клетке – 1 сут.

• Иммунокоррекция – интерлейкин-2, интерфероны, специфические (моноклональные) антитела, пересадка вилочковой железы и костного мозга. • Лечение оппортунистических инфекций (протозойных, микозов, герпетической инфекции, цитомегаловирусной инфекции, бактериальных инфекций. • Противоопухолевые средства. • Патогенетическая и симптоматическая терапия.

Генетика вируса ВИЧ

Интегрированная форма ВИЧ-1 (провирус) содержит приблизительно 9, 8 т. п. н. Оба конца провируса фланкированы повторяющимися последовательностями (LTR-повторами). Гены ВИЧ находятся в центральной части провирусной ДНК и кодируют по крайней мере девять белков: 1. Основные структурные белки (Gag, Pol и Env). 2. Регуляторные белки (Tat и Rev). 3. Дополнительные белки (Vpu, Vpr, Vif и Nef). Геном включает три структурных гена Gag, Pol и Env, четыре гена nef, vif, vpr и vpu, кодирующих так называемые дополнительные белки, два регуляторных, кодирующих регуляторные белки tat и rev.

1. Гены основных структурных белков (Gag, Pol и Env). Эти белки экспрессируются как полипротеины, которые затем разрезаются и дают вирусные белки. Обозначение: LTR –длинные терминальные повотры; RRE – Rev –зависимый элемент; MA – матрикс; CA – капсид; Pro – протеаза; RT – обратная транскриптаза; Rnase – рибонуклеаза Н; IN – интеграза; P – белок; Gp - гликопротеин.

Структурные белки трансмембранные белки липидной оболочки матрикс капсид нуклеокапсид Ферменты Ревертаза Интеграза Протеаза 3 гена – gag, pol и env

Основные структурные белки (Gag, Pol и Env) Ген Env кодирует белок, который экспрессируется с м. РНК, подвергшейся однократному сплайсингу. Белок Env необходим для инфекционности. Клеточная протеаза расщепляет gp 160 с образованием gp 41 и gp 120. Компонент gp 41 содержит трансмембранный домен Env. Ген Pol кодирует обратную транскриптазу. В процессе обратной транскрипции полимераза синтезирует двухцепочечную копию ДНК на димере одноцепочечной геномной РНК, присутствующей в вирусной частице. РНКаза Н удаляет исходную РНК матрицу с первой цепи ДНК, что создает условия для синтеза комплементарной цепи ДНК. Ген Gag кодирует белок Gag, функция которого захватывать две копии вирусной геномной РНК совместно с другими вирусными и клеточными белками, тем самым запуская процесс отпочковывания вирусной частицы от поверхности инфицированной клетки.

Регуляторные белки (Tat и Rev) Ген Tat кодирует белок – транскрипционный трансактиватор, необходимый для репликации ВИЧ-1. Tat связывается с короткой структурой, напоминающей шпильку, известной как трансактивационный реагирующий элемент (TAR), находящийся на 5'конце ВИЧ РНК. Связывание Tat с TAR активирует транскрипцию ВИЧ генома в 1000 раз. Недавно был выяснен механизм функционирования Tat. Основным механизмом действия Tat является ускорение фазы элонгации при транскрипции ВИЧ-1, в результате чего могут образовываться транскрипты полной длины. В отсутствие экспрессии Tat, ВИЧ дает главным образом короткие транскрипты. Функция Tat требует участия клеточного кофактора, известного как циклин Т, который способствует узнаванию района TAR.

Ген Rev кодирует РНК-связывающий белок, который индуцирует переход ранней фазы экспрессии генов ВИЧ в позднюю. Rev связывается с участком РНК со сложной вторичной структурой размером в 240 нуклеотидов, носящим название RRE. Связывание Rev с RRE способствует экспорту из ядра в цитоплазму не подвергнутой сплайсингу и подвергнутой неполному сплайсингу вирусной РНК. Rev абсолютно необходим для репликации ВИЧ-1. Провирусы с отсутствующей функцией Rev являются активными в транскрипционном отношении, однако в них не экспрессируются поздние вирусные гены и, таким образом, вирусные частицы не образуются.

Дополнительные белки (Vpu, Vpr, Vif и Nef) Геном ВИЧ-1 содержит четыре дополнительных гена nef, vif, vpr и vpu, кодирующих так называемые дополнительные белки. Белок Nef ускоряет активацию Т-лимфоцитов, блокирует гибель Тлимфоцитов. Nef также стимулирует инфекционность вирусных частиц. Участвует в прогрессировании ВИЧ-инфекции. Белок Vpr играет роль в способности ВИЧ инфицировать неделящиеся клетки. Он действует как транспортер, непосредственно привязывая вирусный геном к ядерной поре. Vpr может также блокировать клеточное деление в G 2 - фазе. Белок Vpu участвует в стимуляции высвобождения вирионов с поверхности инфицированной клетки. Белок Vif необходим для репликации ВИЧ в лимфоцитах и макрофагах, а также для сборки вирусных частиц.

Терапия ВИЧ

2 3 1 Транскрипция, трансляция 5 4

Этапы цикла размножения вируса, которые подвержены влиянию известных противовирусных средств: 1) Присоединение к клеточной поверхности. Поглощение внутриклеточными везикулами (эндосомами). Выход вирусной нуклеиновой кислоты из оболочки(потеря белковой оболочки, слияние с липидной мембраны эндосомы с лизосомой: роль р. Н). 2) Синтез ДНК на РНК-матрице с помощью обратной транскриптазы. 3) Интеграция ДНК копии в хромосому. 4) Транскрипция, процессинг м. РНК и трансляция. Посттрансляционная модификация белков (гликозилирование, фосфорилирование, ацилирование, протеолиз). Сборка из компонентов целого вируса. 5) Выход вирусных частиц из клетки.

ВИЧ-1 5. PR – протеолитическое исключение вирусных частиц 1. Env – проникновение вируса Вирусная РНК 2. RT-обратная 3. IN-интеграция транскрипция Вирусная ДНК Интегрированный провирус 4. Tat- транскрипция Rev – РНК-экспорт

Fuzeon - синтетический пептид (36 аминокислот). Cвязывается с gp 41 участком трансмембранного гликопротеина оболочки ВИЧ. Azt - синтетический пептид (36 аминокислот). Ингибитор обратной транскриптазы. ВИЧ-1 PR – протеолитическое исключение вирусных частиц Fuzeon Ritonavir Env – проникновение вируса Вирусная РНК RT-обратная транскрипци я Вирусная ДНК Azt Ralteglavir IN-интеграция Tat- транскрипция Rev – РНК-экспорт Интегрированный провирус Ritonavir-ингибитор протеаз. Ralteglavir - ингибитор переноса молекулярной цепи интегразы.

CCR 5 -корепрессор Вирусная РНК Вирусная ДНК Maraviroc – селективно связывается с CCR 5 -рецептором

Стратегии генотерапии ВИЧ Принципиально новым и наиболее перспективным направлением лечения ВИЧ-инфекции сегодня является генотерапия. В результате реализации этого подхода возможно как полное излечение больных СПИДом, так и создание популяции, устойчивой к данному вирусу. Основа современной генотерапии – применение природных механизмов клетки, регулирующих экспрессию генов.

Генетические механизмы устойчивости к ВИЧ CCR 5 - на поверхности нормальных клеток Дефектный CCR 5∆32 обеспечивает устойчивость к ВИЧ CCR 5∆32 -мутация в гомозиготном состоянии делает Т-клетки полностью устойчивым к заражению ВИЧ

Анти-ВИЧ-стратегия Механизм действия Стратегии, основанные на использовании белков 1. Эндогенные белки Связывание вирусов вне клеток и внутри Растворимые CD 4 клеток (посредством Gp 120). рецепторы Использование эндогенных белков. СD 4 -КDEL 2. Трансдоминантно. Блокирование экспорта из ядра вирусной действующие белки м. РНК Rev Блокирование транскрипции вирусного Tat генома Gag Блокирование сборки вирусов Env Стратегии, основанные на использовании нуклеиновых кислот 3. Антисмысловые РНК Антисмысловые. Tat/Rev Антисмысловые Gag Блокрование транскрипции Tat-белков и трансляции Rev-белков Блокирование сборки вирусов Gag-белков 4. Рибозимы 5. Антисмысловые олигонуклеотиды Связывающие РНК Связывающие TAR Связывающие RRE 6. Стимуляция иммунитета ДНК-вакцины Env Блокирование трансляции вирусной РНК Блокирование транскрипции вирусной РНК Блокирование экспорта из ядра вирусной м. РНК Индукция иммунитета Индукция цитотоксического иммунитета

1. Введение в клетки генов, кодирующих эндогенные белки, например, растворимые CD 4 -рецепторы или цитокины MIP-Ia, MIP-Iβ и RAN

Этапы 4 и 5 Использование антивирусных подходов Вирусная РНК Вирусная ДНК Интегрированный провирус

2. Tat и Rev – мишени для генотерапии Трансдоминантно действующие белки Rev, В норме: Tat, Gag и Env ► Белок Tat прикрепляется к TAR и транскрипция всех ВИЧ- транскриптов запускается. ► Белок Rev прикрепляется к RRE-области всех несплайсированных м. РНК и запускает экспорт этих РНК в цитоплазму. Генотерапевтические стратегии Транскрипты вирусной РНК TAR-ловушки 1. TAR и RRE- ловушки. 2. Использование рибозимов для блокирования синтеза Tat и Revбелков. 3. Использование интерферирующих si. РНК против Тat/Rev. 4. Использование Tat и Rev трансдоминантных белков.

2. Tat и 1. Rev –и RRE – ловушки TAR мишени для генотерапии Для того, чтобы предотвратить размножение вируса, было предложено вводить искусственно синтезированную TARпоследовательность в инфицированные клетки (ТAR-ловушку). TAR-ловушка Регуляторному белку Tat все равно, с чем взаимодействовать — с вирусной последовательностью или с такой же точно последовательностью TAR, искусственно внесенной в клетки. Добавленная в клетки ДНК обеспечивает в данном случае роль «ловушки» : когда в инфицированной клетке на ней синтезируется много РНК, регуляторный белок вируса связывается преимущественно с ними, а не с РНК вируса, и в результате этого вирус перестает размножаться.

В отсутствии Rev-регуляции происходит сплайсинг с образованием только маленьких молекул РНК, кодирующих регуляторные белки, а в присутствии Rev синтезированная РНК экспортируется из ядра до того, как она подвергается сплайсингу. Это позволяет образовываться структурным белкам и геномной РНК. Если нет Rev-регуляции вирусные частицы образовываться не могут. Rev-ловушки блокируют нормальное размножение вируса.

Трансактиваторный белок Rev В присутствие Rev • Rev: прикрепляется к RR и стимулирует транспор РНК в цитоплазму. В отсутствие Rev

2. Использование рибозимов

2. Использование рибозимов ВИЧ-РНК Механизм действия рибозимов

Anti-CCR 5 Ribozyme Анти-ССR 5 рибозим Сайт разрезания ССR 5 м-РНК Рибозим

3. Генотерапия ВИЧ с использованием 3. Использование РНК интерферирующих si. РНК На сегодняшний день наиболее изучены механизмы эпигенетического сайленсинга генов (от англ. silence – молчание). К ним относятся РНК-интерференция (защитный механизм, блокирующий работу строго определенных генов и не позволяющий им работать) и хромосомный сайленсинг.

РНК-интерференция является одним из наиболее перспективных направлений генной терапии ВИЧинфекции. Одним из способов доставки малых интерферирующих РНК (si. РНК) в клетки-мишени является использование векторных плазмидных конструкций, обеспечивающих экспрессию РНК данного вида. В результате введения экспрессирующих векторных конструкций в клетку происходит синтез интерферирующих РНК и деградация РНК-мишени, в результате размножение вируса блокируется.

В качестве мишеней были выбраны наиболее консервативные районы областей генома ВИЧ-1 , соответствующих участкам генов pol, gag и области LTR. В лимфоцитарные клетки линии МТ-4 методом электропорации вводили конструкции, экспрессирующие вирусспецифические si. РНК. Для оценки эффективности действия интерферирующих РНК трансфецированные клетки инфицировали штаммом ВИЧ-1 спустя 48 ч после трансфекции. Ингибирующий эффект оценивали по накоплению вирусспецифического антигена р24 методом прямого иммуноферментного анализа на четвертые сутки после трансфекции. Наибольший ингибирующий эффект был достигнут в клетках, трансфецированных векторной конструкцией, содержащей фрагмент гена pol. Было показано снижение уровня накопления вирусспецифического белка p 24 на более чем на 90% по сравнению с нетрансфецированными клетками.

Подавление синтеза CCR 5 -рецептора с помощью si. РНК J Anderson и R Akkina было показано, что использование si. РНК, является высокоэффективным средством дерегуляции этапов заражения ВИЧ на начальных этапах заражения. *Тестирование проводили путем введения si. РНК в клетки Т-лимфоцитов с помощью лентивирусного вектора , а также с использованием стволовых клеток.

4. Использование Tat и Rev трансдоминантных негативных белков (ТНБ) ТНБ (трансдоминантные негативные белки) – это мутантная версия регуляторных или структурных белков, которые участвуя в метаболизме клеток, нарушают их функции путем ингибирования тех или иных процессов. ТНБ Tat и Rev-белков блокируют репликацию, созревание м. РНК и выходу их из ядра в ВИЧ инфицированных клетках.

Например, лечение ВИЧ пациентов путем переноса в их Т-лимфоциты с помощью ретровирусного вектора генов, кодирующих синтез антисмысловой TAR-области и трансдоминантного белка Rev проходит в настоящее время клинические испытания (1 фаза).

Генотерапия ВИЧ Фаза испытания Вектор ретровирус ретровирус лентивирус ретровирус 1 аденовирус Анти-ВИЧ ген против цепи рибозим и Tat антисмысловые РНК рибозим антисмысловые РНК связывающий белок против Т-клетки (аутологические) и

Фаза испытания Вектор Анти-ВИЧ ген Типы клеток ретровирус клетки крови ретровирус клетки мозга ретровирус 1 рибозам рибозим ретровирус лентивирус клетки крови рибозим

Успехи генотерапии ВИЧ Наиболее успешным оказалось использование мутации CCR 5∆d 32 для генотерапии ВИЧ. Эта мутация приводит к изменению структуры CCR 5 -корепрессора на Т лимфоцитах и делает их невосприимчивыми к ВИЧ. Эта генетическая особенность, которая отсутствует среди населения Азии и Африки, встречается преимущественно (до 1%) среди белого населения «в районе Балтийского моря и в Северной Европе» . Гетерозиготное носительство – до 10 %.

Тимоти Брауну, известному как "Берлинский пациент", пересадили стволовые клетки от донора с генетической мутацией CCR 5∆d 32, благодаря которой его иммунная система стала неуязвимой для ВИЧ. Результат – полное выздоровление.

Известен также «пациент из Трентона» . Это один из шести пациентов, которые получали экспериментальную клеточную иммунотерапию SB-728, разработанную Sangamo Bio. Sciences, Inc. Терапия SB-728 основана на экстракорпоральной обработке собственных лимфоцитов с использованием технологии «цинковых пальцев» (Zink Fi. Ngers, ZFN). Введение в клетки аденовирусной конструкции, вносящей мутации в ген CCR 5 Взятие крови Обогащение Тлимфоцитами Инфузия Активация и обработка в течение 10 дней Криоконсервация

Инженерия устойчивых к ВИЧ CD 4+- Т клеток с использованием CXCR-специфической Zink-Finger нуклеазы (ZFN) двухнитчатый надрез и частичная денатурация зашивание пробела с ошибками

На сегодняшний день разрабатывается ряд методов лечения, сводящихся к следующему: ►у пациента, зараженного ВИЧ, получают кроветворные стволовые клетки, осуществляют ZEN-модификацию их методом генной инженерии так, чтобы на их поверхности не осталось пригодных для проникновения ВИЧ в клетки рецепторов CCR 5 (CXCR 4 или других), и вводят обратно пациентам. В этом случае даже не обязательно, чтобы все клетки оказались без рецепторов. Достаточно существования стабильной популяции клеток иммунной системы, устойчивых к ВИЧ, чтобы лечение таких больных сильно упростилось.