Геноміка і геномна інженерія ВСТУП Спецкурс Лекція 1

Геноміка і геномна інженерія. ВСТУП Спецкурс Лекція 1

Геном – Геноміка - Геномна інженерія q Геном – сукупність усіх генів певного організму q Геноміка – розділ генетики, у фокусі якого вивчення структури, функції і еволюції геномів -Структурна геноміка -Функціональна геноміка -Порівняльна геноміка -Метагеноміка q Геномна інженерія – сукупність методів раціонального конструювання геномів, спираючись на докладну інформацію про їхню структуру - етап маніпуляцій з ДНК in vitro відіграє роль допоміжного

Дуже коротка історія секвенування НК Секвенування (sequencing) нуклеїнових кислот – сукупність методів, що дають змогу встановити первинну структуру (послідовність нуклеотидів) ДНК або РНК 1995 – геном Haemophilus influenzae; 1, 8 млн. п. н. Вартість секвенування – прибл. 700 тис. дол. США 2011 – вартість секвенування геному розміром 10 млн. п. н. – прибл. 1000 дол. США Станом на грудень 2011 р. просеквеновано прибл. 3000 геномів прокаріотів і 1000 геномів евкаріотів

Геномна інженерія 10 3 Генна інженерія Синтетична біологія Геномна інженерія 104 Геном 100 Макрофрагмент геному 50 Косміда/фазміда 10 Великий фрагмент на плазміді Окремий ген 0 1 Штучні хромосоми Геном, у т. п. н.

Питання геноміки q Структурна геноміка - Як секвенують геноми і аналізують отримані дані? - Що дає порівняння окремих генів чи цілих геномів? q. Функціональна геноміка - Як вивчають транскрипційну активність геномів і епігенетичні події, що впливають на їхню експресію? - Як змінюються наші уявлення про базові концепції генетики (ген, оперон, мутація, еволюція) у світлі даних геноміки? Докладне розуміння геномної біології організму – основа його геномної інженерії

Геномна інженерія - початки Методи генетичного аналізу бактерій Транспозонний мутагенез - Випадкові інсерції Геном бактерії - Інактивація генів чи активація транскрипції Генні нокаути Фаги, що інтегруються у геном сайт-специфічно - Стабільна експресія чужорідної ДНК - за рахунок гомологічної рекомбінації

Геномна інженерія евкаріотів Застосування до евкаріотів підходів генетичного аналізу бактерій ускладнено: - Багатоклітинні організми - Повільний ріст - Величезний розмір геномів - Низька ефективність рекомбінації гомологічної

Приклади геномної інженерії Мінімізовані геноми бактерій Шовкопряди, що виробляють павутину Генетично модифіковані рослини Генотерапія

Структура спецкурсу Предмет геномної інженерії та її значення Встановлення і аналіз нуклеотидної послідовності геномів Структурна і функціональна організація геномів Персональна геноміка. Організація геномів рослин (на прикладі пшениці) Гени інтеграз евкаріотів та прокаріотів як знаряддя геномної інженерії Генотерапія дефектної Ade-деамінази людини. Використання генів інтеграз бактеріофагів для геномної інженерії дріжджів і ліній клітин ссавців Транспозони евкаріотів та прокаріотів, їхнє застосування у геномній інженерії Використання транспозону Piggy. Bac для геномної інженерії тварин. Розробка нових фагово-транспозонних систем аналізу прокаріотичних геномів МОДУЛЬ – 28 березня, 2 -а пара, ауд. 110 Застосування генів сайт-специфічних рекомбіназ для маніпуляцій геномами Використання генів сайт-специфічних рекомбіназ для геномної інженерії плодової мушки Drosophila. Властивості релаксази-резольвази Zou. A Рекомбініринг Re. Rec – рекомбініринг у дріжджів. Масована заміна кодонів у E. coli Мегануклеаза I-Sce. I. Білки, які містять домен “цинкові пальці” і нуклеази на їхній основі, що застосовуються у геномній інженерії Застосування нуклеаз типу “цинкові пальці” для кукурудзи і дрозофіли 8/II 15/II 22/II 29/II 7/III М М М 14/III М 21/III М 28/III 4/IV 11/IV 18/IV 25/IV

Оцінювання знань Форма контролю Теоретичні Схеми, питання таблиці Модуль 1 3 по 5 балів 10 по 1 = 10 = 15 = 5 балів Участь у семінарах Самостійна робота Іспит Усього 3 по 10 = 30 балів Терміни Тести Підготовка Усього реферату і балів виступ з ним 30 10 10 10 по 1 = 10 5 по 2 = 10 балів 50 100

Оцінювання знань Оцінка ECTS в балах А 90 – 100 В 81 -89 С 71 -80 D 61 -70 Е 51 -60 За національною шкалою Екзаменаційна оцінка, оцінка з диференційованого заліку Іспит 5 4 3 Відмінно Дуже добре Добре Задовільно Достатньо Зараховано

Література 1. Metzker ML. Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet. 2010 Jan; 11(1): 31 -46. 2. Berkman PJ, Skarshewski A, Lorenc MT, Lai K, Duran C, Ling EY, Stiller J, Smits L, Imelfort M, Manoli S, Mc. Kenzie M, Kubaláková M, Šimková H, Batley J, Fleury D, Doležel J, Edwards D. Sequencing and assembly of low copy and genic regions of isolated Triticum aestivum chromosome arm 7 DS. Plant Biotechnol J. 2011 Sep; 9(7): 768 -75. doi: 10. 1111/j. 1467 -7652. 2010. 00587. x. Epub 2011 Feb 28. Pub. Med PMID: 21356002. 3. Kim A, Pyykko I. Size matters: versatile use of Piggy. Bac transposons as a genetic manipulation tool. Mol Cell Biochem. 2011 Aug; 354(1 -2): 301 -9. Epub 2011 Apr 23. Review. Pub. Med PMID: 21516337. 4. Herzog R. W. , Zolotukhin S. A guide to human gene therapy. World Scientific Publishing Co, 2010. – 416 p. 5. Atkinson H, Chalmers R. Delivering the goods: viral and non-viral gene therapy systems and the inherent limits on cargo DNA and internal sequences. Genetica. 2010 May; 138(5): 485 -98. Epub 2010 Jan 19. Review. Pub. Med PMID: 20084428. 6. Calos M. The phi. C 31 integrase system for gene therapy. Curr Gene Ther. – 2006. – Vol. 6. P. 633 -645. 7. Branda C. S. , Dymecki S. M. Talking about a revolution: the impact of sitespecific recombinases on genetic analyses in mice. Developmental Cell. 2004. V. 6. P. 7 -28.

Література 8. Gidoni D. , Srivastava V. , Carmi N. Site-specific excisional recombination strategies for elimination of undesirable transgenes from crop plants. In Vitro Cell Dev. Biol. -Plant. 2008. Vol. 44. P. 457 -467. 9. Isaacs FJ, Carr PA, Wang HH, Lajoie MJ, Sterling B, Kraal L, Tolonen AC, Gianoulis TA, Goodman DB, Reppas NB, Emig CJ, Bang D, Hwang SJ, Jewett MC, Jacobson JM, Church GM. Precise manipulation of chromosomes in vivo enables genome-wide codon replacement. Science. 2011 Jul 15; 333(6040): 348 -53. Pub. Med PMID: 21764749. 10. Wingler LM, Cornish VW. Reiterative Recombination for the in vivo assembly of libraries of multigene pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Sep 13; 108(37): 15135 -40. Epub 2011 Aug 26. Pub. Med PMID: 21876185; Pub. Med Central PMCID: PMC 3174608. 11. Birchler J. A. Plant chromosome engineering: methods and protocols. – Humana Press, Berlin Heidelberg, 2010. – 351 p. 12. van Kessel JC, Marinelli LJ, Hatfull GF. Recombineering mycobacteria and their phages. Nat Rev Microbiol. 2008 Nov; 6(11): 851 -7. Review. Pub. Med PMID: 18923412. 13. Schaffer D. V. , Zhou W. Gene therapy and gene delivery systems. In: Advances in biochemical engineering/biotechnology. – Springer- Verlag, Berlin Heidelberg, 2010. – 295 p.

Література 14. Hughes K. T. , Maloy S. R. Advanced bacterial genetics: use of transposons and phage for genomic engineering. In: Meth Enzymol. – Academic Press, San Diego, USA, 2007. – 283 p. 15. Mackay J. P. , Segal D. J. Engineered zinc finger poteins: methods and protocols. – Humana Press, London, 2010. – 454 p. 16. Zhang Y. , Buchholz F. , Muyrers J. P. P. , Stewart A. F. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat. Genet. 1998. V. 20. P. 123 -128. 17. Klug A. The discovery of zinc fingers and their applications in gene regulation and genome manipulation. Annu Rev Biochem. 2010; 79: 213 -31. Review. Pub. Med PMID: 20192761. 18. Izmiryan A, Basmaciogullari S, Henry A, Paques F, Danos O. Efficient gene targeting mediated by a lentiviral vector-associated meganuclease. Nucleic Acids Res. 2011 Sep 1; 39(17): 7610 -9. 19. Cui X, Davis G. Mobile group II intron targeting: applications in prokaryotes and perspectives in eukaryotes. Front Biosci. 2007 Sep 1; 12: 4972 -85. Review. Pub. Med PMID: 17569624. 20. Güell M, van Noort V, Yus E, Chen WH, Leigh-Bell J, Michalodimitrakis K, Yamada T, Arumugam M, Doerks T, Kühner S, Rode M, Suyama M, Schmidt S, Gavin AC, Bork P, Serrano L. Transcriptome complexity in a genomereduced bacterium. Science. 2009 Nov 27; 326(5957): 1268 -71.

Секвенування ДНК за Сенгером Розроблено Ф. Сенгером у 60 -70 рр. ХХ-го ст. Метод копіювання матриці дидезокситермінуючих похідних д. НТФ. Фрагмент ДНК з використанням

Секвенування ДНК за Сенгером q Матриця (однониткова ДНК) q Мічений праймер q ДНК-полімераза q Суміш д. НТФ і одного дд. НТФ матриця 3 праймер 5 ГААТЦТЦАЦАТТГ 3' Окрема 5 пробірка ДНК-полімераза д. АТФ+дд. АТФ д. ТТФ д. ГТФ д. ЦТФ ЦТТдд. А ЦТТАГАГТГТдд. А ЦТТАГАГТГТААЦ д. АТФ д. ТТФ+дд. ТТФ д. ГТФ д. ЦТФ д. АТФ д. ТТФ д. ГТФ+дд. ГТФ д. ЦТФ Цдд. Т ЦТТАГАГдд. Т ЦТТАГАГТГТААЦ ЦТТАдд. Г ЦТТАГАГТдд. Г ЦТТАГАГТГТААЦ електрофорез д. АТФ д. ТТФ д. ГТФ д. ЦТФ+дд. ЦТФ дд. Ц ЦТТАГАГТГТААдд. Ц

Секвенування ДНК за Сенгером А радіоавтограф лазерний сканер Б q Оптимізація полімераз (поєднання з ПЛР) q Мічені дд. НТФ q Капіляри замість гелю q Краща хімія Додавали дд. Ц 1000 п. н. !

Секвенування ДНК за Сенгером Відео Sangerseq Cycleseq

Секвенування ДНК за Сенгером Ідеальна хроматограма (трейсерний файл) Реально погані дані Реальні дані

Секвенування ДНК за Сенгером Причини поганої якості секвенування за Сенгером початкових і кінцевих ділянок: q Аномальна рухливість дуже коротких мічених ділянок q Гірше розділення великих фрагментів (дифузія) q Зростання фонової флуоресценції Центральні ділянки можуть бути погано просеквеновані унаслідок компресій – формування вторинних структур у ГЦ-багатих районах Надзвичайно важливу роль у розв’язанні більшості цих проблем відіграє програмне забезпечення, що аналізує вихідні дані – хроматограми (трейсерні файли) - визначає межі доріжок (створює т. зв. профіль, або “слід” доріжки), коригує автофлуоресценцію рухливісті коротких і важких фрагментів, виходячи з вимірів флуоресценції – визначає послідовність основ – цей процес ще називається “поклик основ” (base calling)

Секвенування ДНК за Сенгером Програма поклику основ (base caller) Phred q Достовірність (якість) - Q = -10 log 10( Pe ), де Q – якість викликаної основи, Pe - імовірність помилки Величина Q (quality score) 10 20 30 40 50 Імовірність, що основа викликана помилково 1 in 100 1 in 1, 000 1 in 100, 000 Точність поклику основи 90% 99. 9% 99. 999% Q 20, або Phred score 20 – мінімальний промисловий стандарт

Секвенування ДНК за Сенгером Як виправити ці помилки? Кількаразове секвенування послідовності; дальше порівняння кількох “прочитувань” того самого фрагменту ДНК дає змогу виявити випадкові помилки, і, за правилом більшості, визначити найімовірнішу – правильну – послідовність основ. Послідовність, виведена таким способом, називається консенсусною

Секвенування ДНК за Сенгером Секвенування коротких фрагментів (до 1500 п. н. ) Фрагмент, що планують секвенувати, клонують у вектор Вектор, що містить ділянки ( ), комплементарні до праймерів секвенування Циклічне секвенування з двох кінців Дві послідовності що перекриваються

Секвенування ДНК за Сенгером Секвенування великих фрагментів (косміди: 30 -50 т. п. н. ) Систематичний (ієрархічний) підхід 1. Секвенують макрофрагменти з кінців 2. Макрофрагменти субклонують і менші шматки далі секвенують Шотган-підхід Увесь великий фрагмент ДНК у косміді зразу подрібнюють на велику кількість малих фрагментів, що можна просеквенувати з кінців (у складі векторів секвенування)

Секвенування ДНК за Сенгером Ієрархічний Шотган q Трудомісткий q Менше етапів субклонування q Можливість аналізу складних геномів, повторів q Біоінформатично складніший q Вигідний для малих геномів (прокаріоти) Інформація про послідовність спарованих кінців (paired ends або mate ends – різні процедури !) фрагменту ДНК – ключова для успіху обох підходів Спаровані кінці Реконструкція повної послідовності, аналіз повторів…

Секвенування геному за Сенгером divide et impera ! Геном Косміди/ВАС Плазмідні бібліотеки різного розміру (вставки 2 і 10 т. п. н. ) Секвенування плазмідних і космідних бібліотек Вихідні дані Контіги Райони низької якості, прогалини Каркас Закривання прогалин

Секвенування ДНК за Сенгером q Проблема покриття (або глибини секвенування) геному: середнє значення кількості разів секвенування певного нуклеотиду у контігу (геномі), що складено із N фрагментів. Якшо розмір геному – G, і середня довжина фрагменту – L, то покриття R = NL/G. Наприклад, якщо фрагмент завдовжки 4000 п. н. складено із 40 фрагментів розміром 600 п. н. , то кожен нуклеотид у середньому просеквенували 6 разів. Oчікувана кількість контігів (Е), які утворяться у результаті укладання N фрагментів описується формулою Ландера-Уотермана: E = Ne-R Практичний висновок для методу Сенгера: чим довша просеквенована нуклеотидна послідовність вихідних фрагментів – тим менше контігів – і менше прогалин для закривання q Проблема секвенування повторів: неможливо точно просеквенувати повторювану послідовність розміром N, якщо немає спарованих даних секвенування для фрагменту розміром щонайменше N

Секвенування ДНК за Сенгером Схема ієрархічного секвенування великого геному методом Сенгера q Гідроліз геномної ДНК за допомогою ендонуклеаз рестрикції, ультразвуку чи гідродинамічної обробки; фракціонування фрагментів q Створення низки бібліотек геному, що містять великі (30 -50 т. п. н) і малі (2 і 10 т. п. н. ) фрагменти геному q Секвенування космідної і 10 т. п. н-плазмідної бібліотек з кінців вставок (потрібно для дальшого збирання геному) q Секвенування плазмідної бібліотеки зі вставками розміром 2 т. п. н. до 38 -кратного покриття q Складання контігів з первинних даних q Складання контігів у каркаси (використовуючи інфомацію про кінці послідовностей космід) q Закривання прогалин (клонування фрагментів, що не представлені у каркасах, їхнє додаткове секвенування) У шотган-секвенуванн необхідно досягнути набагато більшої глибини секвенування, щоб отримати аналогічні дані – етапи конструювання бібліотек з великими вставками відпадають

Секвенування ДНК за Сенгером Секвенування de novo – підхід до отримання нуклеотидної послідовності геному, що не спирається не використання вже наявної інформації про нуклеотидну послідовність геномів цього ж виду чи близькоспоріднених видів Повторне секвенування. Наприклад, сьогодні відома нуклеотидна послідовність усіх хромосом людини – це т. зв. “збірка-36” (build-36) – усереднена послідовність геномів 50 добровольців, що стали донорами ДНК для проекту “Геном людини”. Секвенування нових геномів людини простіше при врахуванні збірку-36 – слугує каркасом для збирання контігів тощо. Отже, збірка-36 – це референтний геном у цьому випадку. За оцінками експертів, збірка-36 містить 1 помилку на 20000 п. н. (Q 40!). Чорновий геном (драфт) - геном у вигляді фрагментів з середнім розміром 10 т. п. н. , їхнє приблизне розташування у хромосомі відомо, можна виявити близько 95 % генів Пастки при використання референтних геномів – всі помилки референтного геному накладаються на нові геноми, некоректна оцінка поліморфізму)

Секвенування за Сенгером – одним поглядом q Ферментативний метод, заснований на копіюванні матриці q Центральний елемент методу – використання дд. НТФ q Визначення нуклеотидної послідовності іде після завершення реакцій секвенування – за рахунок аналізу рухливості і флуоресценції фрагментів у гелі чи капілярі q Станом на 2011 рік пропускна здатність методу – приблизно 400 реакцій секвенування за один цикл роботи приладу (секвенатора) q Розділення продуктів секвенування – у гелі або в капілярі q Довжина просеквенованих ділянок з Q ≥ 20 – приблизно 1000 п. н. – відносно невелика глибина секвенування (8× для прокаріотів) q Основні типи помилок – транзиції і трансверсії q Був технологічною платформою для першого проекту секвенування геному людини у 90 -х рр. ХХ-го століття q На базі методу відпрацьовано теоретичну базу секвенування НК – впроваджено принцип секвенування спарених кінців, алгоритми оцінки якості, покриття (глибини секвенування) тощо q Оптимальний для секвенування ділянок з повторами, оскільки може просеквенувати довгі фрагменти ДНК