Геноміка і геномна інженерія Транспозони їхнє застосування у

Геноміка і геномна інженерія. Транспозони, їхнє застосування у геномній інженерії Спецкурс Лекція 5

Транспозони: механізми і структури Транспозон Tn 3 - простий IR транспозаза резольваза bla IR Транспозиція за типом копіювання-вставка (copy-paste) – т. зв. реплікативна. Випадкові інсерції.

Транспозони: механізми і структури Транспозон Tn 5 - композитний Транспозиція за типом вирізання-вставка (cut’n paste) – т. зв. консервативний механізм; дуплікація мішені (9 п. н. ) Випадкові інсерції

Транспозони: механізми і структури Транспозон Tn 7 - простий Сайт-специфічна транспозиція за консервативним типом – як Tn 5.

Ретротранспозони евкаріотів

Транспозони: узагальнення механізмів

Транспозони в геномній інженерії бактерій q Транспозази не потребують білкових кофакторів Інтеграція великих фрагментів ДНК Tn трансген IR транспозаза геном Інсерція невеликих фрагментів ДНК (за рахунок дуплікації сайту транспозиції – 2 -9 п. н. ) bla IR

Гіперактивні транспозони L 373 P W 450 C або W 450 S

Транспозони евкаріотів Р елементи – інтегруються у 5’-кінці генів Висока копійність – ідеально для мікроінєкцій Вставки до 100 т. п. н.

Транспозони евкаріотів

Транспозони евкаріотів

Транспозони надродини Тс1/mariner q. Механізм вирізання-вставка qІнтегруються у динуклеотидну послідовність ТА, яку дуплікують Sleeping beauty – реконструйований транспозон риб, 1. 7 т. п. н.

Транспозони надродини Тс1/mariner Сайти розпізнаванння траспозази SB 10 у повторах

SB 10 у генотерапії тварин Переваги q Можна вносити у геном більше, ніж на вірусах q Квазі-випадкова інтеграція (переважно інтрони) низька генотоксичність q Отримано гіперактивні транспозази Недоліки q Дуплікація мішені (ТА) – потенційно мутагенний ефект q Імунна відповідь на транспозазу q Все-таки – генотоксичність q На відміну від вірусів, немає ефективного шляху уведення у клітини – ані in vivo, ні ex vivo q Кожен додатковий 1 т. п. н. фрагмент знижує ефективність транспозиції на 30 % (у клітинах тварин). У клітинах мишки більше 9 т. п. н. не транспозує. Наразі верхня межа – 11 т. п. н.

SB 10 у генотерапії тварин Бінарна система

SB 10 у генотерапії тварин

SB 10 у генотерапії тварин Гідродинамічна ін’єкція ДНК

Ефективність транспозиції як функція довжини q У клітинах ссавців

Ефективність транспозиції як функція довжини Ефективність транспозиції ITR ITR ITR Важче звести ITR у синаптичний комплекс? На плазмідах транспозаза може сприяти суїцидній автоінтеграції (local hopping)

Сендвіч-вектори на основі SB 10 Транспозує втричі краще ніж звичайний вектор з таким самим карго Збільшення кількості сайтів для зв’язування транспозази сприяє цьому

Роль субтермінальних ділянок q Промотори, енхансери, сайти зв’язування білків господаря?

Роль факторів господаря HMGPB 1 – DNA bending protein of high mobility group B 1 IDR - inner binding site ODR – outer bidning site HDR – ennahcer-like sequence Крім HMGPB 1, SB взаємодіє з Miz-1, Ku – білки репарації

Гібридні вірусно-транспозонні вектори

Sleeping Beauty одним поглядом q Механізм – «вирізання-вставка» q Інтеграція у ТА, переважно інтрони q Local hopping q Білкові кофактори господаря впливають на інтеграцію q Дуплікація мішені q Карго – не більше 11 т. п. н. Є потенціал для сендвіч-векторів q Субтермінальні ділянки впливають на транспозицію, експресію q Одинарні і бінарні системи (SB на хелперній плазміді, чи м. РНК) q Метод уведення – гідродинамічна ін’єкція ДНК, ліпофекція, електропорація q Низька імуногенність- цитотоксичніть транспозази при надекспресії q Низька генотоксичність q Легко досягнути однокопійної інтеграції – тимчасова експресія SB q Тривалий і стабільний час експресії трансгенів q Імовірність поступового сайленсингу трансгенів чи транспозази – підбір векторів і промоторів є ключовим q Простота виготовлення порівняно з вірусними векторами q Є транспозиція у зародкових і стовбурових клітинах q Є гібридні вектори – доставка як віруси, інтеграція як SB q 3 2008 року – клінічні випробування для лікування лімфоми

Piggy. Bac – нова родина транспозонів Транспозон Piggy. Bac виділено з капустяної пядениці Trichoplusia ni 2, 4 т. п. н. , кодує лише ген транспозази, що не нагадує інші відомі гени транспозаз Кінцеві повтори критичні для транспозиції in vivo 310 п. н. 250 п. н. Ген транспозази 19 п. н. інвертований повтор 13 п. н. досконалий інвертований повтор

Piggy. Bac Інсерція в ТТАА у контексті ГЦостровів і точне вирізання – не залишає сліду

Piggy. Bac Перенесення величезних фрагментів

Piggy. Bac q Перенесення величезних фрагментів q Точне вирізання – але інколи вирізання неточне, принаймні є такі докази на дрозофілі q Потенційна генотоксичність – інтегрується у точках ініціації транскрипції q Висока активність транспозази – не гірша ніж SB 10, можливо краща q Нема local hopping q Є гомологи у геномі людини q Субтермінальні райони впливають на транспозицію, імовірно на експресію трансгенів чи сусідніх ділянок у районі інтеграції q Працює у стовбурових клітинах q Ширше коло клітин – порівняно з SB – в яких він транспозує q Нижчий ніж SB рівень цитотоксичності унаслідок надекспресії q Постінтегративний сайленсинг – як і в SB q Конструювання безпечних сайтів інтеграції q Вірусно-транспозонні вектори q Оптимізація векторів – мікро-РВ, з вкороченими термінальними ділянками – 60 і 70 п. н. , а не 250 і 310.

Транспозони проти вірусів q. На транспозонах можна перенести більше ДНК q. Набагато вища частота перенесення на вірусах q. Транспозони неімуногенні q. Транспозони менш генотоксичні q. Транспозони простіші і дешевші у клінічній роботі q. Транспозони інтегруються випадково q. Віруси – перевірені на практиці знаряддя генотерапії q. Як змусити транспозази працювати специфічно? q. Як збільшити ефективність перенесення великих фрагментів?

Транспозони в інженерії рослин q. Ac/DS елемент кукурудзи