Геноміка і геномна інженерія. Сайт-специфічні рекомбінази Спецкурс Лекція 6
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР) q Перший компонент - рекомбіназа ССР Cre фага P 1 (надродина λ-інтеграз) ССР Flp з 2 m плазміди Saccharomyces cerevisiae q Другий компонент – сайт (ділянка) рекомбінації lox. P FRT Основна особливість ССР – каталіз реакції у всіх можливих напрямах, лише у залежності від взаємного розташування сайтів рекомбінації
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР) спейсер частина інвертованого повтору
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР)
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР) Конструювання безмаркерних мутацій
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР) Видалення послідовностей вектора
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР) q Потенційна проблема у використанні ССР – вирізання конструкту за наявності ССР може відбутися так само ефективно як й інтеграція. - Як досягнути стабільної інтеграції? q Гетеротипові сайти рекомбінації - ділянки рекомбінації одного типу, що відрізняються за будовою спейсерних послідовностей або повторів. q Два типи – зі змінами у послідовностей спейсера або інвертованих повторів - розмір спейсера (8 п. н. ) є визначальним для ефективної рекомбінації, в той час як його послідовність не є критичною. Такі послідовності не вступаютьу рекомбіназну реакцію, але розпізнаються ССР (повтори не змінені) - Якщо ділянки FRT/lox. P містять нуклеотидні заміни у межах інвертованих повторів, то це порушує здатність рекомбінази зв’язуватись із ДНК. Мутантні сайти зі змінами і лівому повторі можуть з низькою частотою рекомбінувати з сайтами, що містять зміни у правому повторі
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР) q Гетеротипові сайти Сайт1 Повтор 1 Спейсер Повтор 2 lox. P lox 511 lox 5171 lox 2272 m 2 lox 71 ATAACTTCGTATA ATAACTTCGTATA taccg. TTCGTATA ATGTATGC ATGTATa. C ATGTg. Ta. C Aa. GTATc. C Agaa. Acca ATGTATGC TATACGAAGTTAT TATACGAAGTTAT lox 66 ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAcggta FRT F 3 F 5 FRT -10 GAAGTTCCTATTC GAAGTTCa. TATTC TCTAGAAA Ttc. Aa. At. A Ttc. Aa. AAg TCTAGAAA GTATAGGAACTTC FRT+10 GAAGTTCCTATTC TCTAGAAA GTATAt. GAACTTC 1 змінені нуклеотиди надруковані жирними малими літерами Застосування RMCE Інверсія чи інсерція RMCE Інверсія чи інсерція Інверсія чи інерція
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР)
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР)
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР)
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР)
Сайт-специфічні рекомбінази (ССР) q Застосування - інсерціЇ, делеції, інверсії, реципрокні транслокації - In vivo клонування великих фрагментів ДНК. На кінці потрібного фрагмента ДНК вводять сайти рекомбінації, далі експресують ССР – фрагмент вирізається у вигляді ккз-генетичного елемента q Коло господарів – теоретично не обмежене, враховуючи можливості хімічного синтезу генів, адаптованих для експресії у будь-якому організмі q - Передумови використання Відсутність ендогенних сайтів інтеграції Відсутність генотоксичності (пов’язано з першим пунктом) Накопичення багатьох сайтів рекомбінації ( «шрамів» ) може викликати небажані перебудови - Стабільність сайтів рекомбінації
Контроль активності ССР
ССР у генетиці миші Потужний метод конструювання кондиційних нокаутів – ген розташовують між сайтами рекомбнації, при індукції гена ССР ген змінює свою орієнтацію відносно промотора – інвертується Потенційні проблеми - Базальна (leaky) експресія навіть за суворо контрольованих умов - Небажані епігенетичні ефекти при перенесенні ССР у ооцити
ССР у генетиці миші
ССР у генетиці людини Багато псевдо-lox. P сайтів! Платформа приземлення
ССР у генетиці рослин q Накопичення мутацій у сайтах рекомбінацій q Пошук зручних платформ приземлення – щоб уникнути сайленсингу q Для рослин характерні багатокопійні інтеграції. ССР дають змогу спростити характер інтеграції до однокопійної – стабільної у плані успадкування і рівня експресії q Делеції, RMCE, інтеграції, інверсії тощо
Скачать презентацию Геноміка і геномна інженерія Сайт-специфічні рекомбінази Спецкурс Лекція
genome eng-lecture6.pptx