Геноміка і геномна інженерія Рекомбініринг або рекомбіногенна інженерія

Геноміка і геномна інженерія. Рекомбініринг, або рекомбіногенна інженерія Спецкурс Лекція 7

Гомологічна рекомбінація q Практично усі вищерозглянуті методи маніпуляції геномом залишають по собі небажані перебудови – у вигляді векторних послідовностей, дуплікацій сайту транспозиції, шрами рекомбінації після дії ССР q Найкращий підхід – гомологічна рекомбінація Генний нокаут Ділянки гомології

Гомологічна рекомбінація q У більшості організмів гомологічна рекомбінація між коротким лінійним фрагментом гомологічної ДНК (від 20 п. н. до кількох т. п. н. ) і геномом відбувається дуже неефективно (не відбувається) унаслідок дії Rec. DCD q Є винятки, серед них бацили і дріжджі 0 п. н. – десятки тисяч п. н. Ділянка геному, що модифікують геном Маркер(и) Лінійний фрагмент ДНК Ділянка гомології: - мінімум 20 п. н. для Saccharomyces cerevisiae - мінімум 70 п. н. для Bacillus subtilis q Такі лінійні фрагменти ДНК, як зазначено вище, можна створити за допомогою ПЛР

Спеціальні системи гомологічної рекомбінації Фаг лямбда Стан гіперрекомбінації

Спеціальні системи гомологічної рекомбінації

Red. ET-система гомологічної рекомбінації Ділянка гомології – 1 -2 т. п. н Ділянка гомології 40 п. н.

Red. ET-система гомологічної рекомбінації

Red. ET-система гомологічної рекомбінації Не обовязково, відбувається і в rec. A мутантах

Red. ET-система гомологічної рекомбінації Основними компонентами рекомбіногенної інженерії є: q плазміда/фаг, що містить гени exo, bet, gam під контролем індуцибельного промотора; q одно- або двониткова лінійна молекула ДНК, що (необов’язково) містить маркерний ген та (обов’язково) короткі ділянки гомології (35 п. н. і більше) до молекули-мішені (геном, плазміда, косміда тощо); q мікроорганізм, що містить молекулу ДНК, яку планують змінити за допомогою Red-залежної рекомбінації.

Red. ET-система гомологічної рекомбінації 1. Позитивна селекція A Б СМ 2. Селекція, контрселекція A 3. Селекція, сайт-специфічна рекомбінація Б СМ-КСМ A Б СМ 4. Селекція, обробка ЕР A Б СМ лінійна ДНК A A + Б мішень + мішень Red A СМ Б A рекомбінант-1 + A СМ Б A ССР (рекомбінація між ) рекомбінант-2 Б A Б рекомбінант-2 СМ Б рекомбінант-1 Обробка ЕР, лігування Red A Б Red рекомбінант-1 Б + мішень Red СМ-КСМ рекомбінант Б мішень Red Б + A Б рекомбінант-2 Рис. 14. Чотири основні варіанти застосування рекомбіногенної інженерії. У всіх випадках мішенню є епісома (плазміда, ВАС, YAC) чи хромосома господаря. Лінійна ДНК містить дві ділянки гомології (А, Б) до мішені. У найпростішому варіанті (1) досягається заміщення ДНК мішені між ділянками А і Б на селективний маркер (СМ). Варіанти 2 -4 ілюструють, яким чином можна позбутися непотрібних послідовностей у рекомбінантній молекулі по завершенні Red-залежної реакції. Введення контрселективного маркера (КСМ; напр. sac. B чи rps. L) та 2 -й раунд рекомбінації за участю немаркованої ДНК (варіант 2) дозволяють отримати молекулу позбавлену усіх сторонніх послідовностей. Введення сайтів для ССР чи ендонуклеаз рестрикції (ЕР) на кінці СМ та їхнє використання у рекомбіназній та ендонуклеазній реакціях, відповідно, дозволяє отримати молекулу, що міститиме тільки один сайт для ССР чи ЕР (варіанти 3 і 4).

Red. ET-система гомологічної рекомбінації

Red. ET-система гомологічної рекомбінації ori СМ A + ОК A “каркас” Б Б ОК АБО A Б мішень (ккз) Інтактна кільцева молекула Препарат очищеної ДНК Red СМ ori рекомбінант A ОК Б Рис. 15. Пряме клонування та субклонування ДНК з молекул-донорів за допомогою рекомбінірингу. Лінійна векторна молекула ДНК (“каркас”; створюють за допомогою ПЛР) фланкована ділянками А та Б, що є гомологічними до кінців сегменту ДНК, який планують клонувати (ОК). Джерелом ОК можуть бути зразки очищеної лінійної чи кільцевої ДНК; їх разом із “каркасом” вводять за допомогою електропорації в red+ штам. В іншому випадку джерелом ОК можуть бути молекули ДНК, що реплікуються в red+ штамі (хромосома, епісома).

Red. ET-система гомологічної рекомбінації h 1 P 1 FR T СМ ПЛ Р СМ + H 1 P 1 FR T H 1 5’ ген А FR T P 2 H 2 h 2 H 2 ген Б ген В 3’ Електропорація лінійного ф-та в red+ штам E. coli вирощеного за умов індукції red генів Ділянка хромосоми E. coli • Red • Відбір трансформантів за СМ Хромосома геном Б 5’ ген А 5’ із заміщеним H 1 P 1 FR СМ FR P 2 H 2 ген В 3’ T T • Введення у штам хелперної плазміди з геном ССР Flp • Теплова індукція синтезу Flp (43 С), ексцизія СМ та елімінація хелперної плазміди ген А P 1 FR T P 2 ген В 3’ Хромосома із “шрамовою” послідовністю (80 -120 п. н. ) на місці гена Б

Одним поглядом

Одним поглядом Застосування: модуляція генетичного коду

Одним поглядом http: //redrecombineering. ncifcrf. gov/